Nội dung

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH VŨ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUẢ CÁC CÂY GỘI NƯỚC (Anphanamixis polystachya), XÀ CỪ (Khaya senegalensis) VÀ XOAN (Melia azedarach) THUỘC HỌ XOAN (MELIACEAE) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 9. 44. 27. 01 TÓM T T LU N N TI N S HÓA HỌC N An-2018 2 C P N C T ớ ềH ơ, Trung tâm TH-TN, ọ V ọ 1. PGS. TS. Vũ H 2. PGS. TS. H Vă Lự P PGS. TS Trị P PGS. TS. ỗ Quang Huy P PGS. TS. L L P , ầ , T ịT ủ ứ G Hộ 6, N T C T ă t ọ ọ V 019 C 1. T .T ọ Vinh Q ố T V N T N T H –T 1 MỞ ẦU . Lý ọ ề Những năm gần đây có nhiều cây thuốc y học cổ truyền của y học là đối tƣợng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị ung thƣ, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có triển vọng trở thành những chất dẫn đƣờng. Họ Xoan đƣợc quan tâm nghiên cứu trên thế giới với thành phần hóa học của họ Xoan rất đa dạng và phong phú gồm các lớp chất limonoid, mono-, di-, sesqui-, và triterpenoid, coumarin, chromone, lignan, flavonoid.... đặc biệt lớp chất limonoid gần 2000 hợp chất có cấu trúc thú vị, với các hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, ngán ăn côn trùng. Nhiều hợp chất limonoid thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và chống HIV. Cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach) thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây đƣợc trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam, nhƣng cũng đƣợc trồng nhiều ở trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân. Tuy nhiên cho đến nay hầu nhƣ chƣa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây này của Việt Nam đƣợc công bố. Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dƣợc liệu, đƣa dƣợc liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Do vậy, việc nghiên cứu về họ xoan ở Việt Nam là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dƣợc liệu thiên nhiên của nƣớc ta. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “N ứ ầ ọ s ọ ủ q các cây ộ ớ (Anphanamixis polystachya), x ừ (Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach) ộ ọX (Me e e) ở V N ”. . ố ứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ quả các cây quả các cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach) ở Việt Nam. .N ụ ứ - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất từ quả gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), quả xà cừ (Khaya senegalensis) và quả xoan (Melia azedarach). - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc. 2 4. P ơ ứ - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệ. Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao chiết cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. - Phƣơng pháp tách và phân lập: đã sử dụng các phƣơng pháp sắc ký (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP-18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS. - Phƣơng pháp xác định cấu trúc: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã đƣợc sử dụng. - Thăm dò các hoạt tính sinh học kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bảo vệ thực vật. 5. N ớ ủ Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của quả các cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: 1. Từ dịch chiết quả gội nƣớc (Anphanamixis polystachya) đã phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất: - 04 hợp chất limonoid: dysobinin (AP1), chisocheton compound G (AP2), chisocheton compound E (AP3) và 6α - acetoxyepoxyazadiradione VI (AP4); - 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside. Các hợp chất (AP1, AP2, AP3, AP4) lần đầu tiên phân lập từ cây này. 2. Từ dịch chiết quả xà cừ (Khaya senegalensis) phân lập đƣợc 6 hợp chất: - 04 hợp chất limonoid: seneganolide, khayanone, khayanolide B, 6acetoxy-methyl angolensate; - 02 hợp chất flavonoid: (-)-epicatechin và quercitrin. 3. Từ dịch chiết quả xoan (Melia azedarach) phân lập đƣợc 8 hợp chất: - 01 limonoid ớ : 3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1αhydroxytrichilinin đƣợc gọi tên là trichilinin F. - 02 hợp chất flavonoid: apigenin và quercetin 3-O-[-Lrhamnopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside). - 01 hợp chất triterpenoid: taraxerol; - 02 hợp chất phenolic: scopoletin và acid vanillic; - 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside. 3 4. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp chất phân lập: AP2, AP3, KS2, KS3, KS4 với Fusarium oxysporum. Kết quả cho thấy KS3 có hoạt tính kháng nấm mạnh với hiệu quả ức chế trên 80% ở nồng độ 500ppm và không suy giảm sau 7 ngày nuôi cấy. 6. C ủ Luận án bao gồm 112 trang với 21 bảng số liệu, 19 hình và 3 sơ đồ với 109 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (20 trang), kết quả và thảo luận (69 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (8 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 130 phổ của một số hợp chất chọn lọc. CHƯ NG T NG QUAN Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung: 1. Họ Xoan (Meliaceae) - Giới thiệu về đặc điểm chung thực vật của các loài thuộc họ Xoan, thành phần hóa học chính của các cây họ Xoan nhƣ các lớp chất limonoid, mono-, di, sesqui-, và triterpenoid, coumarin, chromone, lignan, flavonoid và các phenolic khác. Bên cạnh đó tổng quan cũng đề cập đến hoạt tính sinh học và ứng dụng của các cây họ Xoan trong nông nghiệp, dƣợc phẩm… 2. Cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya) - Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya) - Thành phần hóa học của cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya) - Hoạt tính sinh học của cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya) 3. Cây xà cừ (Khaya senegalensis) - Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xà cừ (Khaya senegalensis) - Thành phần hóa học của cây xà cừ (Khaya senegalensis) - Hoạt tính sinh học của cây xà cừ (Khaya senegalensis) 4. Cây xoan (Melia azedarach) - Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xoan (Melia azedarach) - Thành phần hóa học của cây xoan (Melia azedarach) - Hoạt tính sinh học của cây xoan (Melia azedarach) CHƯ NG . .P ơ . . .P ơ PHƯ NG PH P VÀ TH C NGHIỆM ứ : 4 Mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệt. Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao chiết cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. . . .P ơ ế x , ,x ị : Để phân tích và phân tách cũng nhƣ phân lập các hợp chất, sử dụng các phƣơng pháp sắc ký nhƣ: phƣơng pháp sắc ký (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP-18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS. . . .P ơ s : Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY; cấu trúc lập thể tƣơng của các hợp chất này đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR. . .4. P ơ ử s ọ Thử hoạt tính sinh học kháng viêm và thử nghiệm sinh học trực tiếp cho hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp chất phân lập với C. acutatum, C. fragariae, C. gloeosporioides, F. oxysporum, B. cinerea và P. obscurans. . .H ế ị 2.2.1. H : Các dung môi ngâm chiết mẫu thực vật thuộc thuộc loại tinh khiết (pure). Các dung môi sử dụng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột thuộc loại tinh khiết phân tích (PA). Các dung môi đƣợc sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etyl axetat, axeton, nƣớc cất. . . . T ế ị: Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3; Độ quay cực đƣợc đo trên máy phân cực kế Jasco DIP -370; Phổ tử ngoại UV đƣợc ghi trên máy quang phổ Hitachi UV-3210, phổ hồng ngoại IR đo trên máy quang phổ Shimadzu FTIR-8501 và Bruker, viên nén KBr; Phổ khối lƣợng (ESI-MS, HRESI-MS) đƣợc đo trên máy Bruker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer Trƣờng Đại học Y Trung Quốc (Đài Loan) và máy micrOTOF-QII 10187 Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh; Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR đƣợc đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và NOESY đƣợc đo trên máy Bruker 125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) với chất chuẩn là TMS; Sắc ký cột sử dụng silicagen cỡ hạt 60,70-230 Kieselgel và 230-240 (Merck). Bản mỏng đƣợc tráng kieselgel 60 và các chất hiển thị bằng dung dịch H2SO4 10% ở 1100 C trong thời gian 10 phút, bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm; dùng hơi Iot (I2) hiện màu. 2.3. N ứ ừq ộ ớ (Aphanamixis polystachya) 2.3.1. Ph ơ 5 Quả cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya) đƣợc thu hái ở khu bảo tồn Vũ Quang-Hà Tĩnh vào tháng 08/2013 và đƣợc PGS. TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học và tiêu bản (DHV-2013) đƣợc lƣu giữ tại khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh. 2.3.2. P Lấy 4,0 kg mẫu khô của quả cây gội nƣớc, sấy ở 40oC, sau đó xay nhỏ rồi đƣợc chiết với metanol ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 tuần. Dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi, thu đƣợc 290g cao. Sau đó chiết lần lƣợt với cloroform và butanol, cất thu hồi dung môi thu đƣợc 106g và 35g cao, tƣơng ứng. Cao cloroform đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi CHCl 3:CH3OH (100:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu đƣợc 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F 1 đến F7) (sơ đồ 2.1) Phân đoạn F1 (8,6 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1), mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu đƣợc 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7). Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã đƣợc sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) với hệ dung môi rửa giải hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu đƣợc hợp chất AP-5 (153 mg). Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexan:axeton (9:1 , 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu đƣợc sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6). Phân đoạn F2.6 (0,5 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) đƣợc giải hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu đƣợc hợp chất AP-1 (41 mg). Phân đoạn F3 (2,7 g) đƣợc sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (9:1, 6:1, 4:1, 1:1, mỗi hệ dung sử dụng 250ml) để thu đƣợc bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4). Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục đƣợc sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x 3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu đƣợc hợp chất AP-2 (31 mg). Phân đoạn F4 (4,7 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5cm) đƣợc rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu đƣợc 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5). Phân đoạn F4.1 tiếp tục đƣợc sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1, 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu đƣợc hợp chất AP-4 (43 mg) và AP-3 (21 mg). Phân đoạn F5 (1,5 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3cm) đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1, 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu đƣợc hợp chất AP-6 (13 mg). 6 7 2.4. N ứ ừ q x ừ (Khaya senegalensis) .4. . M Quả của cây xà cừ (Khaya senegalensis A. Juss) đƣợc thu thập ở Nghệ An vào tháng 1/2014. Mẫu nghiên cứu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Trần Huy Thái (Viện Tài nguyên và Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam). Tiêu bản (DHV 2014) đƣợc lƣu giữ tại khoa Sinh học-Trƣờng Đại học Vinh. 2.4.2. P Quả sau khi sấy khô (4,0 kg) đƣợc xay nhỏ, đƣợc chiết ba lần với MeOH ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết MeOH đƣợc thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu đƣợc cặn màu nâu đen (285,0 g). Cặn methanol đƣợc phân bố trong nƣớc, sau đó chiết lần lƣợt với hexane và ethyl acetate, thu đƣợc 55,0 gam cặn hexane và 95,0 gam cặn ethyl acetate. Cặn ethyl acetate đƣợc tiến hành sắc ký cột trên với hệ dung môi gradient nhexane:acetone (100:0; 50:1; 39:1; 30:1; 20:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1; 1:1) thu đƣợc 7 phân đoạn chính. Phân đoạn 3 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi gradient hexane:acetone (20:1; 15:1; 9:1; 2:1) thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn 3.2 đƣợc tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi nhexane:acetone (20:1) thu đƣợc hợp chất KS2 (23 mg). Phân đoạn 3.3 đƣợc tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane:acetone (9:1; 4:1) thu đƣợc hợp chất KS1 (15 mg) và hợp chất KS3 (29 mg). Phân đoạn 4 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi rửa giải chloroform:methanol (9:1) thu đƣợc hợp chất KS4 (12.5 mg). Phân đoạn 5 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi gradient hexane:acetone (15:1; 9:1; 4:1; 2:1) thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn 5.2 đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi chloroform:methanol (20:1) trên sắc kí cột, sau đó đƣợc tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu đƣợc hợp chất KS5 (53 mg). Phân đoạn 5.4 đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol (15:1, 9:1), sau đó đƣợc làm tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu đƣợc hợp chất KS6 (71,5 mg). 8