Nội dung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------- TRẦN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2015 Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương 2. TS. Lưu Văn Chính Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn Phản biện 2: GS.TS Phạm Văn Ty Phản biện 3: PGS.TS Vũ Đình Hoàng Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại ....................................................................................................................................... vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện quốc gia, Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ 1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Nấm lớn có khoảng 140.000 loài, trong đó có 14.000 loài đã được biết, và khoảng 50% trong số đó được cho là có thể ăn được, hơn 2.000 loài là an toàn với người và khoảng 700 loài có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược. Khoa học đã chứng minh nấm dược liệu có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, chữa các bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch do virus (HIV), chống viêm nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh v.v… (Wasser, 2002; Chang và cs., 2004). Các hoạt chất trong nấm có thể là các phân tử nhỏ như triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm linh chi G. lucidum (Huie và cs., 2004), các hericinone (8 loại) và erinapyron của nấm hầu thủ H. erinaceus (Arnone và cs., 1994), và đặc biệt là hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ các chất phân tử lượng lớn như polysaccharide và glycoprotein. Phần nhiều, polysaccharide ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật v.v…) mà không hây hại tế bào chủ. Hiện nay chưa có loại thuốc đặc hiệu chữa ung thư. Các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là áp dụng liệu pháp miễn dịch nhờ sử dụng các chất từ thiên nhiên (đặc biệt beta-glucan từ nấm) kích hoạt, điều hòa hệ thống miễn dịch (đại thực bào, tế bào đơn nhân …) của cơ thể tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật). 2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes), với những nội dung chủ yếu sau: Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ quả thể nấm. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm của các chất đã phân lập. Tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm. Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực nghiệm (khả năng kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục hồi chức năng gan của sản phẩm) 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes) ở Việt Nam theo định hướng hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch. 3.2. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư gan (HepG2), ung thư mô liên kết (RD) và hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch của các polysaccharit phân lập từ 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes). 2 3.3. Là công trình đâu tiên chiết tách các hoạt chất từ nấm hương (Lentinula edodes) và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch. 3.4. Là công trình đầu sử dụng β-1,3/1,6-glucan tách từ nấm hầu thủ để bao curcumin tạo ra sản phẩm Cur-Glu có kích thước nano (50 nm) và tan tốt trong nước. Sản phẩm Cur-Glu có hiệu quả ức chế rõ rệt và phức gắn đựợc vào tế bào ung thư làm cho tế bào phát quang. (Kết quả này đã được công bố trên tạp chí quốc tế Chemistry Letter, vol.40, No8, p. 846-848) 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 174 trang với 41 bảng số liệu, 54 hình-sơ đồ, 187 tài liệu tham khảo và 11 phụ lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (41 trang), Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Chương 3: Thực nghiệm (20 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (74 trang), Kết luận (3 trang), Các công trình đã công bố (2 trang), Tài liệu tham khảo (22 trang), Danh mục các phụ lục (1 trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên Thế giới và trong nước về các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm dược liệu. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nấm hương Chủng nấm hương (Lentinula edodes (Berk.) Sing.) được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Nấm nấm hương khô được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.1.2. Nấm hầu thủ Chủng nấm hầu thủ (Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers) được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Nấm hầu thủ khô được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.2. Các phương pháp phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) hợp chất đường. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký cột (CC) 2.3. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ 2.3.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương Theo phương pháp của Chihara và cs, 1970. 2.3.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ Theo phương pháp của Mizuno và cs., 1999 3 2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:  Phổ khối lượng (MS)  Điểm nóng chảy (MP)  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide Theo phương pháp của Dubois và cs., 1956. 2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3-glucanase 2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan 2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996. 2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro Theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao và cs. (2007), hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. 2.10. Các phương pháp thử dược lý 2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp của Abrham (1978) và Turner (1965). Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y. 2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn Phương pháp được mô tả bởi Abrham W.B. (1978) và theo quy định của WHO (2000) và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn trong nghiên cứu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên. Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y. 2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y. 2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid 2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn Phương pháp được mô tả bởi Irwin Samuel (1967). 2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm Theo phương pháp của Santos G.W., Mansour H. (1968) và Phạm Mạnh Hùng (1984) 4 2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm Theo phương pháp của Irina G. Agafonova và cs., 2008 và được thử nghiệm tại Viện Hàn lâm Khoa học Nga 2.10.4. Xử lý số liệu Theo phương pháp thống kê dùng trong y-sinh-dược học. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel (Nguyễn Xuân Phách và cs, 1995) CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM 3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các chất từ nấm hương theo định hướng hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch. 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương Nấm hương khô (2 kg) Chiết siêu âm với EtOH 95% Dịch Bã nấm 0 Làm lạnh ở 4-10 C Kết tinh Cất loại dm Cặn chiết EtOH (65 g) NH1 (6g) Nước (100C) Dịch chiết nước Cặn nấm I 1% NH4 oxalate EtOH - Bổ sung nước - Bổ sung n-hexan (100C) P1 (76,8g) Lớp n-hexan Dịch chiết axit Cặn n-hexan (22 g) Cặn II NaOH (5%), 60C EtOH Bổ sung EtOAc P2 (50g) Lớp etyl axetat Lớp nước Chiết BuOH Cặn etyl axetat (15g) Cặn BuOH (18 g) Dịch chiết kiềm EtOH P3 (221,6g) Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương Cặn III 5 Cặn n-hexan (22g) Silica gel CC NH-A1 n-hexan/axeton NH-A249/11/1 NH-A3 (1,5g)Silica gel CC (1.3g) (900mg) NH2nNH3 hexan/axeton: (150mg) (50mg) 3/1-1/1 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3 3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương Dịch lên men nấm hương (1 lít) - Ly tâm 5000v/phút - Loại bỏ cặn Dịch - Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1) - Ủ 4C - Ly tâm 10000v/phút Cặn P4 (5,2 g) Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hương 3.1.3. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương P1 (25,2 g) 2L nước, khuấy. Tủa với CTAOH 0.2M K. tủa 20% acetic acid K. tủa CTA-OH 50% acetic acid K. tủa Hòa tan trong 6% NaOH Dịch tan Ethanol, 3 v K. tủa Loại protein bằng phương pháp Sevag Polysaccharide tinh sạch (15,2 g) NH-GL Sơ đồ 3.4. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương 6 3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các chất từ nấm hầu thủ 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ Nấm hầu thủ khô (2 kg) Chiết siêu âm với EtOH 95% Dịch Cặn nấm Nước (100C) Cất loại dm Cặn chiết EtOH (25 g) - Bổ sung nước Cặn I Dịch chiết nước 1% NH4 oxalate (100C) EtOH - Bổ sung n-hexan Lớp nước Lớp n-hexan P1 (120g) Dịch chiết axit Cặn n-hexan (15 g) Bổ sung EtOAc Lớp etyl axetat EtOH P2 (30g) Lớp nước NaOH (5%), 60C Dịch chiết kiềm Cặn III EtOH Chiết BuOH Cặn etyl axetat (7g) Cặn II P3 (320g) Cặn BuOH (3 g) Sơ đồ 3.5: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ Cặn n-hexan (15g) Cặn etyl axetat (7 g) Silica gel CC Silica gel pha thường và pha đảo nHT-A3 HT-A1 HT-A2hexan/axeton (900mg) (4,5g) 9/11/1 Làm lạnh, kết Sephadex tinh lại HT2 Silica gel CC HT1 - Lọc rửa nhiều (52mg) (500mg) nlần bằng aceton lạnh HT3 (8 mg) HT4 (20 mg) HT5 (125 mg) hexan/axeton Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm hầu thủ 4/1 HT6 (15 mg) 7 3.2.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ Dịch lên men nấm hầu thủ (1 lít) - Ly tâm 5000v/phút - Loại bỏ cặn Dịch - Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1) - Ủ 4C - Ly tâm 10000v/phút Cặn P4 (3,6 g) Sơ đồ 3.7. Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ 3.2.3. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ P3 (160 g) Cột DEAE cellulose (Cl -) Tinh sạch 1 (40g) Cột Sapharose CL6B Tinh sạch 2, β-1,3/1,6 glucan (14,54g) Sơ đồ 3.8. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ 3.2.4. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3glucanase Dịch -Glucan 5% beta glucan (5mg/ml) trong đệm citric 25mM enzyme 5’ D1 15’ 120’ 60’ D2 D3 D4 Bất hoạt enzyme, 100C Tủa EtOH tới 25% Dịch HT-GL1 Tủa EtOH tới 40% Dịch HT-GL2 Tủa EtOH 70% HT-GL3 Dịch Sơ đồ 3.9. Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ bằng emzyme 8 3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin  glucan Curcumin tinh khiết H O trao đổi ion (tỉ EtOH tuyệt đối (tỉ lệ 1:1) 2 lệ 1:1) Dịch  glucan Dịch Curcumin Khuấy đều trên máy khuấy từ trong o điều kiện chân, t phòng, 48 giờ Hỗn hợp A Làm bay hơi từ từ dung môi ở nhiệt độ trong phòng trong thời gian 24 h DD B Ly tâm 3 lần dung dịch Cur-Glucan rồi lọc và loại bỏ phần Cur không được bao lắng xuống Dung dịch Cur-Glu Đông khô Bột Cur-Glu Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ và curcumin 3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm Tạo ra 01 sản phẩm thử nghiệm (HG1) có thành phần gồm: 35 % β-1,3/1,6-glucan (từ phân đoạn polysaccharide P3 của nấm hầu thủ); 0,1 % là các chất có hoạt tính khác trong nấm hầu thủ; 64,9 % chất mang. 3.4. Thử dược lý chế phẩm 3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp Thí nghiệm được tiến hành với các nhóm chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình là 20 ± 2,0 g. Trước khi cho chuột uống HG1, chuột được chuẩn bị trước 16 giờ. Chế phẩm nghiên cứu HG1 được cho uống với các mức liều tăng dần. Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán. Sau khi cho uống HG1, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp do xưởng sản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống ad libitum. Thời gian theo dõi liên tục trong 72 giờ. Số chuột chết được đếm theo nhóm. Tính toán: theo phương pháp cải tiến của Livschitz (1986)