Nội dung

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG NG DỤNG D NG TS. Nguyễn Hòai Hương Dùng cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009 MỤC LỤC Trang Giới thiệu môn học 4 Bài 1 Vi khun amôn hóa 5 I Lý thuyết 5 II Thực hành 5 1. Môi trường - hóa chất 5 2. Tiến hành thí nghiệm 6 3. Quan sát và ghi nhận kết quả 7 III Bài nộp 8 Bài 2 Vi khun nitrate hóa 9 I Lý thuyết 9 II Thực hành 9 1. Môi trường - hóa chất 10 2. Tiến hành thí nghiệm 10 3. Quan sát và ghi nhận kết quả 10 III Bài nộp 11 Bài 3 Vi khun phản nitrate hóa 12 I Lý thuyết 12 II Thực hành 12 1. Môi trường - hóa chất 12 2. Tiến hành thí nghiệm 13 3. Quan sát và ghi nhận kết quả 13 III Bài nộp 14 Bài 4 Vi khun cố định nitơ 15 I Lý thuyết 15 II Thực hành 16 1. Môi trường - hóa chất 16 2. Tiến hành thí nghiệm 17 3. Quan sát và ghi nhận kết quả 17 III Bài nộp 18 Bài 5 Vi khun phân hủy cellulose 19 2 I Lý thuyết 19 II Thực hành 20 1. Môi trường - hóa chất 20 2. Tiến hành thí nghiệm 20 3. Quan sát và ghi nhận kết quả 20 Bài nộp 21 Tài liệu tham khảo 22 Phụ lục 23 III 3 GIỚI THIỆU MÔN HỌC Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men. Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phNm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh. Các bước chung của bài thực hành là 1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại 2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện thuộc vi sinh vật phân lập được. NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐNNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 4 BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA I. Lý thuyết Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuN n và nấm khuN n ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản phN m đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S. Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuN n và nấm khuN n ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuN n và trực khuN n kỵ khí tùy nghi. II. Thực hành Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone. Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa. Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của khuN n lạc các vi khuN n khác nhau này. 1. Môi trường - hóa chất - Môi trường canh thịt- peptone: Cao thịt 5g Peptone 10g Nước 1000ml 5 - Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch. - Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng. Giấy lọc loại thấm acetate chì - Giấy quỳ đỏ - Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử - Thuốc thử Nessler: Hòa tan 50 g KI trong 35 ml nước cất không đạm. Thêm dung dịch HgCl2 bão hòa cho đến khi xuất hiện kết tủa. Thêm 400 ml KOH 50% pha lõang đến 1 l, để lắng, sử dụng dịch trong. 2. Tiến hành thí nghiệm Chu
n bị môi trường: - Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm, 15 phút. - Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5 atm. - Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở 30OC Chu
n bị mẫu: - Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng: - Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106 - Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịtpeptone đã khử trùng ở trên - Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào giữa nút bông và ống nghiệm - Ủ ở nhiệt độ 30OC trong 3 ngày đêm. - Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù. Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch: - Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106 - Lấy 0,1 ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên - Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch 6 - Ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày đêm. - Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù. 3. Quan sát và ghi nhận kết quả Môi trường lỏng: Quan sát: - Sự đục môi trường - Sự tạo bông, kết cạn - Nổi váng trên bề mặt. Phản ứng sinh hóa: - Thử với thúôc thử Nessler: nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa: Màu vàng nhạt – ít ammoniac Vàng sậm – nhiều ammoniac Nâu – rất nhiều ammoniac - Dùng giấy quỳ thử sự sinh NH3 (làm giấy quỳ hóa xanh). - Quan sát màu giấy lọc thấm acetate chì: sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen. - - So sánh đối chứng và thí nghiệm và ghi kết quả vào bảng sau: Độ pha Đục môi loãng trường Tạo bông Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi. Môi trường thạch: Ghi nhận: - Số lượng khuNn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng - Quan sát hình thái khuNn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng sau: Độ pha loãng Số khun lạc Hình thái Xuất hiện bào tử khun lạc 7 - Làm tiêu bản và soi kính hiển vi - So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch - Chụp hình khuNn lạc, tế bào. III. Bài nộp - Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào. - Nêu ứng dụng vi khuNn amôn hóa. 8 BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA I. Lý thuyết Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2. Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrate hóa qua 2 giai đoạn: Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrite bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuNn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuNn keo-các tế bào không di động. Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite thành nitrate bởi một số vi khuNn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuNn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặc trưng là hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao. Vi khuNn nitrate hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH3 và nitrite. II. Thực hành Việc phát hiện vi khuNn nitrate hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi trường này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO3. Nguyên liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuNn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrate hóa là NH3 và muối amôn, còn đối với vi khuNn gây ra giai đoạn hai là nitrite. 9 Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuNn nitrate hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi trường nuôi cấy. 1. Môi trường - hóa chất - Môi trường Winogradski phân lập Nitrosomonas spp. (NH4)2SO4 2 g/l K2HPO4 1 g/l MgSO4.7 H2O 0,5 g/l FeSO4 . 7H2O 0,4 g/l NaCl 2 g/l Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO3. Hấp khử trùng ở 1 atm - Môi trường phân lập Nitrobacter spp. NaNO2 1,0 g MgSO4. 7H2O 0,5 g FeSO4. 7H2O 0,03 g NaCl 0,3 g Na2CO3 1,0 g K2HPO4 1,0 Nước 1L Chỉnh pH về 7,3. - Dung dịch pha loãng mẫu - Tinh thể diphenylamin - H2SO4 đậm đặc 2. Tiến hành thí nghiệm - ChuNn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm - Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng: Pha loãng mẫu 102 - 105 Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên Ủ ở 30OC trong 2-3 tuần - Làm 1 ống nghiệm đối chứng 3. Quan sát và ghi nhận kết quả: 10