Nội dung

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN MUTANS STREPTOCOCCI VÀ LACTOBACILLI Cao Hữu Tiến*, Nguyễn Thị Thu Hiền*, Vũ Thị Lan Hương* TÓM TẮT Mục đích: Phân lập được chủng thuộc nhóm mutans streptococci và lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt lấy từ bệnh nhân sâu răng và xác định môi trường đặc trưng và chọn lọc cho các nhóm vi khuẩn này. Phương pháp nghiên cứu: Mẫu nước bọt từ bệnh nhân có sâu răng được thu thập, sau đó phân lập vi khuẩn và làm thuần. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa được khảo sát để định danh vi khuẩn, sau đó nuôi cấy thử nghiệm lên một số môi trường khác nhau. Kết quả: Phân lâp được hai chủng L1 và L2 thuộc lactobacilli và hai chủng S1 và S3 thuộc nhóm mutans streptococci. Mật độ tế bào lactobacilli trên môi trường Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) và môi trường Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) là tương đương nhau. Mật độ khuẩn lạc trên môi trường Mitis Salivarius Bacitracin Agar nhiều hơn mật độ khuẩn lạc trên môi trường Mitis Salivarius Agar. Kết luận: Môi trường thích hợp cho lactobacilli là Rogosa SL và Lactobacilli MRS, nhưng môi trường Rogosa SL chọn lọc cho lactobacilli miệng hơn vì thành phần muối trong Rogosa SL vượt mức cho phép phân lập các lactobacilli từ sữa. Môi trường chọn lọc cho mutans streptococci là Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Từ khóa: sâu răng, lactobacilli, mutans streptococci ABSTRACT BACTERIAL CUTURE MEDIA FOR MUTANS STREPTOCOCCI AND LACTOBACILLI Cao Huu Tien, Nguyen Thi Thu Hien, Vu Thi Lan Huong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 210 - 219 Objectives: To isolate strains of mutans streptococci and lactobacilli from saliva samples of patients suffering from tooth decay and determine the selective media for those group of bacteria. Methods: Bacteria are isolated from salivary samples collecting from tooth decay patients. Morphological, physiological and biochemical characteristics are observed to identify bacteria, and then inoculated to test onto variety of culture media. Results: Two strains of lactobacilli (L1, L2) and two strains of group of mutans streptococci (S1, S3) have isolated. Lactobacilli cell density on Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) and Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) is equivalent. The density of colonies on Mitis Salivarius Bacitracin Agar is more than the density of colonies on Mitis Salivarius Agar. Conclusions: Culture media for lactobacilli are Rogosa SL and Lactobacilli MRS, however, Rogosa SL is more selective for oral lactobacilli because high salt content in Rogosa SL is not suitable for isolating lactobacilli from milk. Selective media for mutans streptococci is Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Key words: caries, lactobacilli, mutans streptococci * Bộ môn Sức khỏe răng miệng – Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS. Cao Hữu Tiến, ĐT: 0909464212 Email: caohuutien@gmail.com 210 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu răng là bệnh khởi phát một thời gian dài trước khi nhìn thấy trên lâm sàng, vì thế việc đánh giá sâu răng ở giai đoạn sớm khi sang thương chưa nhìn thấy được là rất quan trọng. Xác định được nguy cơ sâu răng của bệnh nhân sẽ giúp đảm bảo mức dự phòng và điều trị thích hợp. Một trong những phương pháp đánh giá nguy cơ sâu răng thường được sử dụng đó là đếm số lượng mutans streptococci và lactobacilli trong nước bọt. Tuy nhiên, hiện nay để làm xét nghiệm này phải dựa vào những bộ kit làm sẵn của các hãng nước ngoài với chi phí rất cao gây khó khăn cho việc ứng dụng, đặc biệt là trong nghiên cứu khoa học. Chính vì thế để có môi trường nuôi cấy chọn lọc tự làm của hai nhóm vi khuẩn này phục vụ cho các nghiên cứu nha khoa và trong ứng dụng lâm sàng là điều cần thiết. Mục tiêu của đề tài này là phân lập được chủng thuộc nhóm mutans streptococci và lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt lấy từ bệnh nhân bị sâu răng, sau đó tham khảo, tìm hiểu những môi trường mà các chủng này có khả năng hiện diện và xác định môi trường đặc trưng và chọn lọc cho chủng vi khuẩn khảo sát. Nghiên cứu Y học Dung dịch hydrogen peroxide 30% trong chai màu nâu, tránh ánh sáng Phẩm nhuộm Gram Môi trường Mitis Salivarius Agar (MSA) (MT1) Mitis Salivarius Bacitracin Agar (MSB) (MT2): môi trường MSA có bổ sung 20% saccharose và 0.2 units/ml Bacitracin Mitis Salivarius Bacitracin Broth (MT3) Rogosa SL Agar (MT4) Rogosa SL Agar có bổ sung 0,5% CaCO3 (MT4’) Rogosa SL Broth (MT5) Môi trường tổng hợp Lactobacilli MRS Agar (MT6) Môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) Môi trường Luria-Bertani (LB) (MT8) Môi trường Phenol Red Mannitol Broth (MT9) Môi trường Blood Agar (Thạch máu) (MT10) Phương pháp thực hiện * Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm: Thu mẫu từ bệnh nhân VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Dụng cụ Bình ủ kỵ khí Phân lập vi khuẩn và làm thuần Giữ giống Pipetman 1000, 100 Pipet 1.0ml, 10.0ml Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, kính hiển vi, kính lúp,… Hóa chất Một số hóa chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy. Anaerocult® A (của hãng MERCK KGaA) chứa các thành phần hóa học mà có thể kết hợp với oxy nhanh chóng và hoàn toàn, tạo ra một môi trường không có O2 (kỵ khí) và một bầu không khí CO2 dùng để nuôi kỵ khí. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Chọn chủng để thử nghiệm nuôi cấy Kết luận Mẫu nước bọt Mẫu nước bọt được lấy từ những bệnh nhân có sâu răng Cách lấy mẫu Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 211 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Trong vòng 90 phút trước khi thu thập nước bọt, yêu cầu nhóm đối tượng cho nước bọt không được ăn cũng như uống bất cứ thứ gì, không được nhai kẹo cao su, không đánh răng và sử dụng nước súc miệng. Thời gian lấy nước bọt vào khoảng 8 giờ 30 đến 11 giờ sáng. Các bước thực hiện: Cho đối tượng ngồi thẳng trong tư thế thoải mái, đầu nghiêng nhẹ về phía trước Quan sát và chọn những khuẩn lạc vi khuẩn rời rạc khác nhau, có vòng phân giải CaCO3 xung quanh khuẩn lạc mọc trên môi trường MT4’. Sau đó tiếp tục cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT4 nhiều lần cho đến khi thu được những khuẩn lạc đồng nhất về hình thái. Giữ giống trong môi trường MT10. Đối với mutans streptococci Kích thích sự tiết nước bọt bằng cách cho nhai 1 mẫu paraffin Tương tự như lactobacilli, tiến hành trải trên môi trường MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí (5-10%CO2). Thu nhận những đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ. Tương tự lactobacilli, cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT2. Giữ giống trong môi trường MT10. Nước bọt được thu thập trong một ống nghiệm tiệt trùng Phương pháp khảo sát đặc điểm của tế bào vi khuẩn đã phân lập Ngay trước khi thu mẫu nước bọt, yêu cầu đối tượng nuốt lần cuối tất cả lượng nước bọt có trong miệng. Thời gian thu thập là 5 phút Khảo sát khả năng di động Mẫu được bảo quản trong tủ đông đá Đối với lactobacilli, các chủng nuôi cấy lỏng trên môi trường MT5, ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí; với mutans streptococci, các chủng nuôi cấy trên MT3, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí. Dùng que cấy khử trùng lấy vi khuẩn hoặc dùng pipetman hút 1 ít huyền phù tế bào vi khuẩn được nuôi cấy 2-3 ngày, để vào giữa một miếng lame sạch, đặt miếng lamelle lên sao cho không tạo bọt khí. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10, sau đó chuyển sang quan sát ở vật kính x40. Mẫu nước bọt được pha loãng theo dãy thập phân. Phương pháp nuôi kỵ khí Xếp đĩa Petri hoặc ống nghiệm vào bình kỵ khí Lấy 35ml nước đổ lên tấm Anaerocult® A cho chảy đều, sau đó nhanh chóng bỏ vào bình kỵ khí và đậy nắp lại ngay lập tức. Chú ý không quá 15-20 giây. Anaerocult ® A có tác dụng sau 4 giờ khi màu sắc của tấm Anaerocult ® A chuyển từ màu trắng sang màu xanh dương. Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt Đối với lactobacilli Pha loãng mẫu bằng nước muối 0,9% vô trùng. Dùng pipetman hút 0,1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 vào đĩa Petri có chứa môi trường MT4’, tiến hành trải bằng que gạt. Mỗi độ pha loãng trải 2 đĩa liên tiếp nhau. Ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí (510%CO2), ta thu nhận được những đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ. 212 Nhuộm Gram(1) Nhuộm bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút Nhuộm Lugol trong 1 phút Rửa bằng nước Tẩy bằng alcol bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho alcol chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt alcol vừa mất màu tím Rửa bằng nước Nhuộm bổ sung Safranin hoặc Fuchsin từ 10 – 30 giây Rửa nước Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Để mẫu khô tự nhiên và xem dưới kính hiển vi (x100) Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase(7) Tiến hành: Đối với lactobacilli, các chủng nuôi cấy lỏng trên môi trường MT4, ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí. Đối với mutans streptococci, các chủng nuôi cấy trên MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí. Thử nghiệm trên phiến kính: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên miếng lame sạch. Dùng pipet nhựa hút H2O2 30% rồi nhỏ một giọt lên sinh khối vi sinh vật trên lame. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Chủng dùng làm đối chứng là E.coli. Đọc kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mannitol Tiến hành: Cấy chủng vào ống môi trường MT9 trong ống nghiệm đã chuẩn bị bằng que cấy vòng từ các chủng đã làm thuần trên môi trường chon lọc. Sau khi cấy, ủ 35±10C trong 72 giờ, 5-10% CO2 đối với lactobacilli và 37±10C trong 48 giờ, 5-10%CO2 đối với mutans streptococci. Đọc kết quả: Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid. Sinh acid là (+) khi môi trường với chất chỉ thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại nếu môi trường có mà đỏ thì sự sinh acid (-). Phương pháp dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD550nm - Chủng đại diện cho lactobacilli đem nuôi cấy lỏng trên môi trường MT8, ủ 35±10C trong 72 giờ, 5-10% CO2 - Pha loãng huyền phù tế bào lactobacilli sao cho thu được các huyền phù có OD550nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 rồi ghi nhận Nghiên cứu Y học các số đo thực tế. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. - Hút 0,1ml dịch vi khuẩn ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa Petri có chứa môi trường MT6 và tiến hành cấy trải. Ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí (5-10% CO2). Sau đó đếm số khuẩn lạc trên đĩa Petri ở mỗi độ pha loãng để xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này, ghi nhận kết quả. - Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi giá trị OD550nm. * Cách tính: Số khuẩn lạc (N) được xác định bằng cách đếm (25 ≤ N ≤ 300). Mật độ tế bào (N/ml) là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1ml mẫu ( N / ml )  Với chọn N n1vf1  ...  ni vf i N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã ni: Số lượng đĩa Petri đã cấy ở độ pha loãng thứ i v: Thể tích dịch mẫu sử dụng để cấy trải vào trong mỗi đĩa (0,1ml) fi: Độ pha loãng tương ứng Tính log(N/ml) - Vẽ đường biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD550nm (trục hoành) theo chương trình vẽ biểu đồ của Microsoft Excel 2003. Phương pháp so sánh mật độ tế bào giữa các môi trường Đối với lactobacilli Nuôi cấy lỏng lactobacilli trên hai môi trường MT5 và MT7. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng lactobacilli cấy sang ống nghiệm có chứa khoảng 15ml môi trường MT5 và MT7, ủ 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí (5-10%CO2). Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 213 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Sau đó tiến hành pha loãng dịch mẫu sao cho OD550nm có giá trị nằm trong khoảng 0,1-0,5. Ghi nhận giá trị OD550nm và hệ số pha loãng. Từ giá trị OD550nm thu được, thay vào phương tình đường thẳng được suy ra từ đồ thị. Ta được giá trị Log(N/ml). Từ Log(N/ml), ta tính N/ml Mật độ tế bào có trong 1ml = N/ml x hệ số pha loãng Đối với mutans streptococci Kết quả phân lập được hai chủng có vòng phân giải CaCO3, kí hiệu L1, L2. Cả hai chủng đều có khuẩn lạc tròn, ướt. Tuy nhiên khuẩn lạc L1 lồi, có màu trắng sữa; khuẩn lạc L2 có màu trắng đục và nhô hình nón (bảng 3.1). Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc của chủng L1, L2 Chủng vi khuẩn L1 L2 Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc tròn, lồi, màu trắng sữa, ướt và nhầy Khuẩn lạc tròn, ở giữa nhô lên hình nón, màu trắng đục, ướt Sử dụng đĩa Petri có ngăn phần, mỗi phần chứa một môi trường để so sánh mật độ. Nuôi cấy chủng mutans streptococci đã phân lập được trên hai môi trường MT1 và MT2. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng S1 cấy một đường thẳng lên hai môi trường trên cùng đĩa Petri có ngăn phần. Ủ 37±10C, 48 giờ trong điều kiện kỵ khí (510%CO2). Sau đó quan sát sự hiện diện của khuẩn lạc trên hai môi trường. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập sơ bộ vi khuẩn từ mẫu nước bọt Phân lập lactobacilli Theo nghiên cứu của một số tác giả như Johannes Van Houte và cs (1972)(9); P.W.Caufield và cs (2007)(4)…, lactobacilli được phân lập từ nước bọt, mảng bám răng và trên bề mặt biểu mô miệng bởi môi trường thạch Rogosa SL. Rogosa SL là môi trường cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho lactobacilli, ngoài ra muối sodium acetate, ammonium citrate ức chế sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật, bao gồm Streptococcus. Việc bổ sung acid acetic giúp sự phát triển của lactobacilli tốt hơn và ức chế các vi khuẩn khác. Lactobacilli là trực khuẩn có khả năng sinh acid lactic nên có khả năng làm tan CaCO3. Từ những lý do trên, để phát hiện và khẳng định tốt hơn, chúng tôi phân lập lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt của bệnh nhân sâu răng trên môi trường thạch Rogosa SL có bổ sung 0,5% CaCO3. 214 Hình 1: Khuẩn lạc chủng L1 và L2 Phân lập mutans streptococci Tương tự, chúng tôi phân lập mutans streptococci trên môi trường chọn lọc cho mutans streptococci là Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Môi trường này có Crystal violet và Trypan blue ức chế hầu hết các trực khuẩn Gram âm và hầu hết các vi khuẩn Gram dương trừ Streptococcus, cung cấp nguồn đường (sucrose) dồi dào cho quá trình chuyển hóa, đặc biệt Bacitracin là kháng sinh cho phép chọn lọc mutans streptococci. Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Trên môi trường này đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt, kí hiệu S1,S2, S3. Đặc điểm của 3 chủng S1, S2, S3 được mô tả ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Đặc điểm khuẩn lạc của chủng S1, S2 và S3 Chủng vi Nghiên cứu Y học khuẩn S1 S2 S3 Khuẩn lạc nhỏ, tròn lồi, cứng, ăn sâu vào thạch, có một lớp bóng sáng trên bề mặt của các khuẩn lạc. Khuẩn lạc lớn, màu xanh nhạt, mờ đục Khuẩn lạc nhỏ, cứng, tròn lồi Đặc điểm khuẩn lạc Hình 2: Khuẩn lạc chủng S1, S2 và S3 Khảo sát đặc điểm của tế bào vi khuẩn đã phân lập Đối với lactobacilli Sau khi nuôi cấy lỏng hai chủng L1 và L2 trên môi trường MT5 ở 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí. Tiến hành khảo sát khả năng di động và đặc tính Gram của hai chủng L1 và L2. Nhận thấy, chủng L1 là vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương và có khả năng di động; chủng L2 là vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương và không di động (bảng 3.3). Bảng 3.3: Các đặc điểm tế bào của chủng L1 và L2 Chủng vi khuẩn L1 L2 Hình dạng tế bào Khả năng di Gram động Hình que, dạng chuỗi + + Hình que, dạng đơn + Hình 3: Nhuộm Gram chủng L1 và L2 Đặc điểm của hai chủng L1 và L2 giống với đặc điểm của lactobacili theo lý thuyết là những trực khuẩn hình que và Gram dương. Đối với mutans streptococci Tương tự lactobacilli, sau khi nuối cấy ở 37±10C, 48 giờ trong điều kiện kỵ khí. Tiến hành khảo sát khả năng di động và đặc tính Gram của ba chủng S1, S2 và S3. Kết quả thu được cả ba Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 215 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học chủng đều có tế bào hình cầu, Gram dương, không di động (bảng 4). Bảng 4: Các đặc điểm tế bào của chủng S1, S2 và S3 Chủng vi khuẩn Hình dạng tế bào S1 S2 S3 Hình cầu, dạng chuỗi Hình cầu, dạng đôi Hình cầu, dạng chuỗi - + + + Khả năng Gram di động Hình 3.4: Nhuộm Gram chủng S1, S2 và S3 Từ kết quả khảo sát đặc điểm tế bào của các chủng S1, S2và S3, nhận thấy đặc điểm của ba chủng này phù hợp với đặc điểm của mutans streptococci theo lý thuyết là những vi khuẩn hình cầu dạng đơn, đôi hay chuỗi, Gram dương và không di động. Thử nghiệm nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase Cả 2 chủng L1, L2 đều cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính. E.coli L1 Chủng S2 cho kết quả thử nghiệm catalase dương tính. Hai chủng S1 và S3 cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính. Từ thử nghiệm Catalase cho kết quả chủng S2 dương tính. So với những đặc điểm của nhóm mutans streptococci là catalase âm tính, như vậy S2 không thuộc nhóm mutans streptococci. E.coli L2 Hình 5: Thử nghiệm catalase của chủng L1 và L2 216 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 E.coli S1 Nghiên cứu Y học E.coli S2 E.coli S3 Hình 6: Thử nghiệm catalase chủng S1, S2 và S3 Cả bốn chủng L1, L2, S1, S3 đều có khả năng lên men đường mannitol sinh acid làm chất chỉ thị phenol đỏ chuyển màu vàng. Điều này chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh acid từ sự lên men đường. Từ những đặc điểm tế bào khảo sát được, kết quả của các thử nghiệm sinh hóa cùng với đặc điểm của lactobacilli và mutans streptococci theo lý thuyết, kết quả thu được: - Chủng L1 và L2 thuộc lactobacilli - Chủng S1 và S3 thuộc nhóm mutans streptococci Chọn chủng L1 đại diện cho lactobacilli và chủng S1 đại diện cho mutans streptococci để thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường. Thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường khác nhau Đối với chủng thuộc lactobacilli Chúng tôi nuôi cấy lỏng chủng L1 trên môi trường Lactobacilli MRS Broth, để dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD550nm. Kết quả đo mật độ quang của các ống nghiệm để dựng đồ thị ở bảng 3.5. Bảng 5: Kết quả đo OD550nm để dựng đường tương quan Ống nghiệm OD550nm OD 1 2 3 4 1,275 1,381 1,469 0 0,106 0,194 5 1,587 0,312 6 1,693 1,778 0,418 0,503 Ống nghiệm 1: Môi trường (MT7) Ống nghiệm 2,3,4,5,6: Dịch khuẩn pha loãng Bảng 6: Số liệu giữa OD550nm và Log(N/ml) Số khuẩn lạc Độ pha loãng -4 10 10-4 10-4 -5 10 10-5 10-6 OD 0,106 0,194 0,312 0,418 0,503 Đĩa 1 26 113 285 28 162 70 N/ml Đĩa 2 29 127 >300 32 176 67 log(N/ml) 2,8x10 1,2x107 6 6,45 7,08 2,9x10 7 7,46 1,7x108 6,9x108 8,23 8,84 Từ số liệu bảng 3.6, dùng chương trình vẽ đồ thị của phần mềm Microsoft Excel, dựng đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào Log(N/ml) và OD550nm. 9 y = 5.8136x + 5.8276 R2 = 0.984 8.5 Log(N/ml) Thử nghiệm khả năng lên men đường Mannitol Khả năng lên men của các chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid. Sinh acid là (+) khi môi trường với chất chỉ thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại nếu môi trường có màu đỏ thì sự sinh acid (-). 8 7.5 7 6.5 6 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD550nm Hình 7: Biểu đồ tương quan giữa log (N/ml) và OD550nm Phương trình đường thẳng: Y = 5,8136X + 5,8276 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 217 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Sau khi nuôi cấy lỏng chủng L1 trên hai môi trường MT5 và MT7 sau 72 giờ, đo mật độ quang OD550nm thu được kết quả ở bảng 3.7. Bảng 7: Kết quả đo OD550nm của chủng L1 trên hai môi tường MT5 và MT7 Môi trường MT5 MT7 OD550nm (Môi trường) OD550nm (Dịch khuẩn đã pha loãng) OD Số lần pha loãng 0,974 1,335 1,275 1,655 0,361 10 0,380 10 Dựa vào đồ thị đường tương quan giữa log(N/ml) và OD550nm và phương trinh đường thẳng, chúng tôi tính được mật độ tế bào của chủng L1 trong hai môi trường MT5 và MT7. Kết quả thu được ở bảng 3.8 Bảng 8: Kết quả OD550nm và Log(N/ml) của chủng L1 trên hai môi trường MT5 và MT7 Môi trường Giá trị OD Log(N/ml) N/ml MT5 MT7 0,361 0,380 7,93 8,04 0,85x109 1,1x109 Với kết quả này, mật độ tế bào lactobacilli trên môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) (1.1x109 N/ml) lớn hơn trên môi trường Rogosa (MT5) (0,85x109 N/ml), tuy nhiên không đáng kể. Điều này cho thấy thành phần dinh dưỡng của hai môi trường Rogosa SL và Lactobacilli MRS nhìn chung tương tự nhau. Về giá trị kinh tế, môi trường Rogosa SL thành phần tryptone có giá cao hơn peptone ở Lactobacilli MRS. Đối với chủng thuộc nhóm mutans streptococci Chủng thuần S1 được nuôi cấy trên trên hai môi trường MT1 và MT2, sau 48 giờ thu được kết quả ở hình 3.8 và bảng 3.9. Bảng 9. Mật độ chủng S1 trên hai môi trường MT1 và MT2 Môi trường MT1 MT2 Mật độ chủng S1 ++ ++++ MT1 Hình 8: Mật độ chủng S1 trên hai môi trường MT1 và MT2 Mật độ khuẩn lạc trên môi trên môi trường MT2 nhiều hơn mật độ khuẩn lạc trên môi trường MT1, điều đó cho thấy khi bổ sung 20% saccharose và 0,2 Units/ml Bacitracin giúp cho sự chọn lọc mutans streptococci cao hơn. KẾT LUẬN Từ mẫu nước bọt đã phân lâp được hai chủng L1 và L2 thuộc lactobacilli và hai chủng S1 và S3 thuộc nhóm mutans streptococci Mật độ tế bào lactobacilli trên môi trường Lactobacilli MRS Broth (1.1x109 N/ml) và môi trường Rogosa SL (8.5x108 N/ml) là tương đương nhau. Môi trường Rogosa SL chọn lọc cho lactobacilli miệng hơn môi trường Lactobacilli MRS vì thành phần muối trong Rogosa SL vượt mức cho phép phân lập các lactobacilli từ sữa. Mật độ khuẩn lạc trên môi trên môi trường Mitis Salivarius Bacitracin Agar nhiều hơn mật độ khuẩn lạc trên môi trường Mitis Salivarius Agar. Khi bổ sung 20% saccharose thì khả năng phục hồi của mutans streptococci tốt hơn và 0,2 Units/ml Bacitracin giúp cho môi trường mang tính chọn lọc đối với mutans streptococci. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2. 3. 218 MT2 Bộ môn vi sinh (2007). Thực tập vi sinh cơ sở. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Bộ môn xét nghiệm (2002). Vi sinh y học. Đại học Y Dược TP.HCM. Burgess RC(1988), Dental Caries, Can. Fam. Physician Vol. 34 10pp. Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 4. 5. 6. Caufield PW, Li Y, Dasanayake A and Saxena D (2007). Diversity of lactobacilli in the oral cavities of young women with dental caries. Caries Res; 41 (1): 2-8. Doi:10.1159/000096099. Elen RP, Fillery ED, and Banting DW (1980). Comparison of Selective Broth and Plating Methods for Isolation of Streptococcus mutans from Root Surface Dental Plaques. Journal of Clinical Microbiology, 5pp. Nishikawara F, Nomura Y, Imai S, Senda A, Hanada N (2007). Evaluation of Cariogenic Bacteria, European Journal of Dentistry, 4pp. 7. 8. 9. 10. Nghiên cứu Y học Trần Linh Thước (2009). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. Trần Linh Thước, Lê Thị Thúy Ái, Nguyễn Mỹ Phi Long (2009). Thực tập vi sinh. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Van Houte J, Gibbons RJ, and Pulkkinen AJ (1972). Ecology of Human Oral Lactobacilli, American Society for Microbiology, 7pp. Wade WG, Aldred MJ and Walker DM (1986). An improved medium for isolation of Streptococcus mutans, The Pathological Society of Great Britain and Ireland, 6pp. Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 219