Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02

pdf
Số trang Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02 7 Cỡ tệp Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02 353 KB Lượt tải Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02 0 Lượt đọc Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02 0
Đánh giá Thiết kế vector chỉnh sửa gen IPA1 liên quan đến tính trạng năng suất của giống lúa chất lượng J02
4.7 ( 19 lượt)
Nhấn vào bên dưới để tải tài liệu
Để tải xuống xem đầy đủ hãy nhấn vào bên trên
Chủ đề liên quan

Nội dung

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 Hoàng Thị Huệ, Lã Tuấn Nghĩa, Hoàng Tuyết Minh, Nguyễn Thị An Trang, Lã Hoàng Anh, Phạm Thị Thùy Dương, Chu Thị Mây, 2017. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hai giống lúa màu: Khẩu cẩm xẳng và lúa Bát. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 8, tr. 36-40. Đào Minh Sô, 2011. Ảnh hưởng của phân khoáng và phân bón lá đến năng suất lúa cạn tại Ea Súp, Đắk Lăk. Tạp chí Nông nghiệp và PTNN, kỳ 1 - tháng 6/2011, tr. 15-21. IRRI, 2002. Standard Evaluation System (SES) for Rice. IRRI, Los Baños, Philippines. Effects of sowing time, transplanting density and fertilizer dose on the growth and yield of local rice variety Khau dac na Hoang Thi Hue, Hoang Thi Thu Thuy, La Tuan Nghia Abstract Khau dac na is a local glutinous rice variety which has been being grown in Tuong Duong district, Nghe An province for long time. Study on sowing time, transplanting density and fertilizer dose aims to increase the yield of Khau dac na rice variety. Khau dac na is a photosensitive variety and suitable sowing time is from 10 – 22 June and transplanting time is from 4 – 14 July (22 days of seedlings). The appropriate transplanting density is 40 hills/m2. The fertilizer dose: 01 tons of microbial organic fertilizer + 80 N + 90 kg P2O5 + 80 kg K2O is most suitable for the varietiy. Keywords: Khau dac na rice variety, sowing and transplanting time, transplanting density, fertilizer dose, yield Ngày nhận bài: 03/12/2020 Ngày phản biện: 11/12/2020 Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu Ngày duyệt đăng: 22/12/2020 THIẾT KẾ VECTOR CHỈNH SỬA GEN IPA1 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT CỦA GIỐNG LÚA CHẤT LƯỢNG J02 Phùng Thị Thu Hương1, Phạm Thu Hằng1, Cao Lệ Quyên1, Phạm Xuân Hội1, Nguyễn Duy Phương1 TÓM TẮT Với mục đích tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về cải tiến năng suất của giống lúa J02 chất lượng cao, công trình nghiên cứu đã tập trung vào việc phân lập, giải trình tự vùng mã hóa exon III của IPA1-J02 liên quan đến các tính trạng năng suất ở giống lúa J02, thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa IPA1-J02 và thiết kế T-DNA mang cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa IPA1-J02. Kết quả đã đưa được cấu trúc biểu hiện sgRNA mang 2 trình tự crRNA nhận biết 2 vị trí khác nhau trên exon III của IPA1-J02 vào vector nhị phân pCas9. Vector pCas9/gRNA-IPA1 đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt enzyme giới hạn để phục vụ nghiên cứu tăng năng suất cho giống lúa chất lượng cao J02 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen. Từ khóa: Chỉnh sửa gen, năng suất, CRISPR/CAS9, IPA1, đột biến ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực được tiêu thụ rộng rãi nhất trên toàn thế giới. Vai trò quan trọng của lúa gạo đối với kinh tế và xã hội đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu phát triển các giống lúa mới với các đặc tính nông học được cải thiện, như khả năng chống chịu stress sinh học/phi sinh học, kháng thuốc diệt cỏ hoặc nâng cao năng suất và giá trị dinh dưỡng. Việc phát triển giống lúa có cấu trúc thân cây lý tưởng được cho là một 1 phương án tiềm năng góp phần nâng cao năng suất lúa so với các giống năng suất hiện nay (Fan et al., 2006; Mao et al., 2010). Gen IPA1 được xác định là một QTL quan trọng quy định kiến trúc thân cũng như năng suất cây lúa. IPA1 mã hóa cho protein OsSPL14 (SOUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 14) và được điều tiết bởi miRNA OsmiR156. Đột biến điểm xuất hiện trên IPA1 tại vị trí tương tác giữa OsSPL14 với OsmiR156 ở giống Taichung Native 1 (Indica) và Viện Di truyền Nông nghiệp 49 Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 Aikawa, Shaoniejing (Japonica) có thể tạo ra dòng lúa “lý tưởng” hơn với kiểu hình giảm số nhánh, tăng tính kháng (increased lodging resistance), thân dày và cứng cáp, tăng năng suất (Jiao et al., 2010; Miura et al., 2010). Trong nghiên cứu của Li và cộng tác viên (2016), gen IPA1 của giống lúa Zhonghua 11 đã được gây đột biến bằng hệ thống CRISPR/Cas9 tại vị trí nằm trên exon III, gần vị trí mã hóa axit amin tương tác với OsmiR156 (vị trí 854 đến 876). Các dòng lúa chuyển gen mang nhiều dạng đột biến khác nhau tại ví trí mục tiêu và có năng suất được cải thiện rõ rệt (Li et al., 2016). Những kết quả trên cho thấy, vùng exon III của gen IPA1 có thể là một mục tiêu quan trọng để điều chỉnh cấu trúc thân cây lúa, giúp tăng năng suất hạt. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và phân tích một đoạn trình tự gen IPA1 của lúa J02 (gọi tắt là IPA1-J02) nhằm thiết kế CRISPR/Cas9 gây đột biến chính xác trên gen IPA1, tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để cải tiến năng suất của các giống lúa chất lượng cao và thích nghi tốt với điều kiện môi trường bất lợi. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Giống lúa J02 do Công ty Giống cây trồng Phú Thọ cung cấp; chủng vi khuẩn E. coli DH5α được mua từ hãng Thermo Fisher Scientific (Mỹ). Vector pENTR4/gRNA và pCas9 do nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Sebastien Cunnac (Trung tâm Nghiên cứu vì sự phát triển, Montpellier, Pháp) cung cấp, được thiết kế dựa trên bộ khung vector pCAMBIA1300 (Marker Gene Technologies, Hoa Kỳ) và pENTR4 (Invitrogen, Hoa Kỳ). Các oligonucleotide dùng cho PCR được đặt mua từ hãng Sigma (Mỹ). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết DNA từ lúa DNA tổng số của cây lúa được tách chiết theo phương pháp của Doyle và Doyle, (1990) sử dụng dung dịch CTAB 2%. Mẫu lá lúa (100 mg) được nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn, sau đó được bổ sung 500 µl dung dịch CTAB 2% (có chứa ARNase 40 mg/ml) và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút để thu dịch nổi. 500 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl (25 : 24 : 1) được bổ sung vào dung dịch để kết tủa protein. Hỗn hợp sau đó được ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút để thu DNA tinh sạch. 50 2.2.2. Thiết kế trình tự gRNA chỉnh sửa IPA1-J02 Đoạn exon III của gen IPA1 (AP014968.1) được phân lập từ DNA tổng số của cây lúa J02 bằng kỹ thuật PCR (Sambrook and Russel, 2001), sử dụng hai mồi IPA1-Fw (5’-AAGAGCATCGCAGGTTCA-3’) và IPA1-Rv (5’-GTCCTCGACAATACAGCATTAA-3’). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GenJET-TM Gel Extraction (Thermo Fisher Scientific) và giải trình tự nucleotide theo phương pháp của Smith và cộng tác viên (1986). Kết quả giải trình tự được xử lí bằng phần mềm BioEdit 4.0, so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank và phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0. Trình tự gRNA đặc hiệu cho chỉnh sửa vùng exon III của IPA1-J02 được thiết kế bằng phần mềm CRISPR-P v2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/ CRISPR2/). Cấu trúc bậc II của các gRNA được phân tích bằng phần mềm Mfold 2.3 (http://unafold. rna.albany.edu/). Đoạn DNA tương đồng với các gRNA trong hệ gen lúa được xác định bằng phần mềm CCTop (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de). Trình tự gRNA (20 Nu) được đặt tổng hợp bởi công ty Sigma (Hoa Kỳ). 2.2.3. Thiết kế vector chỉnh sửa IPA1-J02 Hai cặp oligonucleotide BtgZI-IPA1-F/BtgZI-IPA1-R (5’-tgttGAGAGCACAGCTCGAGTCGG-3’ và 5’-aaacCCGACTCGAGCTGTGCTCTC-3’) và BsaI-IPA1-F/BsaI-IPA1-R (5’-gtgtGGTGGATGTCTCGCAGGGGT-3’ và 5’-aaacACCCCTGCGAGACATCCACC-3’) được liên kết với nhau bằng phản ứng biến tính/phục hồi DNA (95oC-10 phút, 4oC-∞) để tạo thành 2 crRNA sợi đôi hoàn chỉnh (IPA1-gRNA1 và IPA1-gRNA2). IPA1-gRNA1 và IPA1-gRNA2 được lần lượt chèn vào vị trí enzyme BtgZI và BsaI nằm sau vùng promoter OsU6.1 và OsU6.2 trên vector pENTR4/gRNA (Hình 1). Vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi U6.1-F/BtgZI-IPA1-R (0,36 kb), BsaI-IPA1-F/ Ter-R (0,19kb) và BtgZI-IPA1-F/BsaI-IPA1-R (0,44 kb). Tiếp theo, đoạn trình tự chứa 2 cấu trúc [U6.1::IPA1-gRNA1]và [U6.2::IPA1-gRNA2] (0,94 kb) được ghép nối vào vị trí enzyme HindIII trên vector nhị phân pCas9 bằng T4 DNA ligase. Vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-IPA được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi Ubi-F/Cas9-R (0,36 kb), BtgZI-IPA1-F/ BsaI-IPA1-R (0,44 kb) và giải trình tự DNA. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 Hình 1. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCas9/gRNA-IPA 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 4 năm 2020 tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vùng exon III của IPA1-J02 Vùng exon III của IPA1 đã được xác định mang bộ ba mã hóa cho vị trí axit amin tương tác với yếu tố điều hòa OsmiR156 trên protein OsSPL14, có vai trò quyết định đến năng suất hạt (Fan et al., 2006; Mao et al., 2010). Chính vì vậy, vùng exon III của IPA1-J02 (vị trí [+583] đến [+1501]) đã được phân lập bằng PCR để phục vụ mục đích thiết kế gRNA chỉnh sửa IPA1-J02. Sản phẩm PCR nhân bản từ DNA tổng số của lúa J02 bằng cặp mồi đặc hiệu có kích thước xấp xỉ 0,93 kb tương ứng với kích thước lí thuyết của đoạn trình tự cần phân lập (933 bp) (Hình 2, giếng 2). Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn DNA phân lập được chứa toàn bộ vùng exon III (918 bp) của IPA1 (Hình 3), giống lần lượt 100% và 99,89% so với trình tự tương ứng của giống lúa Japonica Nipponbare (AP014964.1) và Indica Shuhui498 (CP018164.1) đã được công bố trên GenBank. Trong các nghiên cứu trước đây, một số QTL (quantitative trait loci - QTLs) liên quan tới tính trạng năng suất hạt cũng đã được chọn làm mục tiêu trong các nghiên cứu cải thiện năng suất lúa bằng công cụ CRISPR/Cas (Shen et al., 2018). Li và cộng tác viên (2016) đã gây đột biến 4 gen Gn1a , DEP1, GS3 và IPA1 liên quan đến tính trạng số lượng hạt, cấu trúc bông, kích thước hạt và cấu trúc thân của giống lúa Zhonghua 11. Trong nghiên cứu này, vùng exon I của Gn1a và IPA1 và exon III của DEP1 và IPA1 đã được chọn làm mục tiêu cho các sgRNA vì các đột biến ở các vùng đó đã được chứng minh là có khả năng hình thành kiểu hình mong muốn (năng suất cao hơn). Trong nghiên cứu này, toàn bộ vùng exon III trên IPA1 của giống lúa J02 cũng đã được nhân bản bằng PCR từ DNA tổng số để phân tích trình tự nucleotide phục vụ cho việc thiết kế gRNA chỉnh sửa gen IPA1. Hình 2. Kết quả phân lập vùng exon III của IPA1-J02 từ hệ gen lúa J02 bằng kĩ thuật PCR Ghi chú: Giếng M: Thang chuẩn DNA 1kb (iNtRon); Giếng 1: Đối chứng âm (không có DNA khuôn); Giếng 2: Khuôn là DNA tổng số của lúa J02. 3.2. Thiết kế trình tự gRNA chỉnh sửa IPA1-J02 Hoạt động cắt sợi đôi DNA của hệ thống CRISPR/ Cas9 vận hành dựa trên sự phối hợp của 2 thành phần chính là protein Cas9 có hoạt tính endonuclease và phân tử sgRNA (single guide RNA) có vai trò dẫn đường cho phức hệ protein-RNA CRISPR/Cas9 tới 51 Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 vị trí cần cắt trên DNA. Trong đó, trình tự crRNA (khoảng 20 nucleotide) trên phân tử sgRNA có vai trò quy định tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/ Cas9 (Bortesi and Fischer, 2015). Để đảm bảo chức năng, trình tự crRNA đầu 3’ phải nối tiếp với trình tự bảo thủ PAM (NGG), có độ dài 19 - 20 Nu và vị trí cắt DNA nằm trên trình tự đích (Doench et al., 2016; Fu et al., 2014; Liang et al., 2016). Trong nghiên cứu này, các trình tự crRNA chỉnh sửa exon III trên gen IPA1 của lúa J02 đã được thiết kế dựa trên phần mềm CRISPR-P v2.0. Kết quả phân tích (Bảng 1) đã thu được 17 trình tự crRNA đáp ứng đầy đủ 3 điều kiện trên và đều đảm bảo việc hình thành cấu trúc bậc II ổn định trong nhân tế bào thực vật. Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả gây đột biến, crRNA cần có điểm On-score cao (khả năng hoạt động cao) và ưu tiên có Guanine ở đầu 5’ (là yếu tố giúp các cấu trúc biểu hiện RNA điều khiển bởi gen U6 hoạt động hiệu quả hơn) (Doench et al., 2016; Fu et al., 2014; Liang et al., 2016). Chính vì vậy, trình tự crRNA-10 và crRNA-11 có chứa đầu G và điểm On-score cao nhất (0,5435 và 0,4230) đã được lựa chọn để tiếp tục phân tích. Bảng 1. Trình tự crRNA chỉnh sửa IPA1-J02 Tên Trình tự crRNA-PAM (5’-3’) Kích thước TBP CBP IBP DSL % GC On score crRNA-1 TGTGGGTAGTAGTATCCCA-TGG 19 9 3 0 - 45% 0,7063 crRNA-2 CTTCTGTCAACCCAGCCAT-GGG 19 10 5 0 - 55% 0,6310 crRNA-3 TCTTCTGTCAACCCAGCCA-TGG 19 11 5 0 - 50% 0,5435 crRNA-4 CCCCTGCGAGACATCCACC-TGG 19 9 3 0 - 65% 0,3475 crRNA-5 CTGCGAGACATCCACCTGG-AGG 19 9 3 0 - 60% 0,1933 crRNA-6 TGCGAGACATCCACCTGGA-GGG 19 9 3 3 - 60% 0,1539 crRNA-7 GGTAGTAGTATCCCATGGC-TGG 19 9 5 4 - 50% 0,0344 crRNA-8 GTGGATGTCTCGCAGGGGT-CGG 19 10 4 0 - 65% 0,0113 crRNA-9 TCTTCTGTCAACCCAGCCAT-GGG 20 11 5 0 - 50% 0,0972 crRNA-10 GAGAGCACAGCTCGAGTCGG-TGG 20 11 5 0 - 65% 0,5435 crRNA-11 GGTGGATGTCTCGCAGGGGT-CGG 20 10 5 0 - 65% 0,4230 crRNA-12 ACCCCTGCGAGACATCCACC-TGG 20 8 3 0 - 65% 0,3475 crRNA-13 GGTAGTAGTATCCCATGGCT-GGG 20 9 5 4 - 50% 0,2034 crRNA-14 CCTGCGAGACATCCACCTGG-AGG 20 9 3 0 - 65% 0,1933 crRNA-15 CTCTTCTGTCAACCCAGCCA-TGG 20 10 5 0 - 55% 0,1780 crRNA-16 CTGCGAGACATCCACCTGGA-GGG 20 9 3 0 - 60% 0,1539 crRNA-17 GGGTAGTAGTATCCCATGGC-TGG 20 9 5 5 - 55% 0,0344 Ghi chú: (% GC) tỉ lệ phần trăm GC; (TBP) tổng số cặp bazơ; (CBP) số cặp bazơ liên tục; (IBP) số cặp bazơ trong cấu trúc của crRNA; (DSL) vòng loop bị phá vỡ cấu trúc; (-) không ảnh hưởng đến cấu trúc vòng loop; (On score) Điểm dự đoán khả năng nhận biết đúng vị trí đích (từ 0,00 - 1,00). Do crRNA chỉ nhận biết ~20 nucleotide và Cas9 vẫn có thể hoạt động dù trình tự DNA đích có một vài nucleotide sai khác so với crRNA (Bae et al., 2014; Bortesi and Fischer, 2015; Doench et al., 2016), tính đặc hiệu của các trình tự crRNA tiếp tục được phân tích bằng phần mềm CCTop (http://crispr.cos. uni-heidelberg.de). Kết quả phân tích cho thấy trong khi trình tự crRNA-11 không có trình tự tương đồng nào trong hệ gen lúa, crRNA-10 có 7 trình tự DNA tương đồng (Bảng 2). Tuy nhiên, hầu hết các trình 52 tự tương đồng với crRNA-10 đều có chứa ít nhất 1 Nu trong vùng lõi nên khả năng gây đột biến ngoài mục tiêu không cao (Doench et al., 2016; Fu et al., 2014; Liang et al., 2016). Mặc dù vậy, bước sàng lọc đột biến ở các thế hệ cây chỉnh sửa gen sau này vẫn nên kiểm tra các vị trí tương đồng với crRNA này để đảm bảo không xảy ra đột biến không mong muốn (Doench et al., 2016; Fu et al., 2014; Li et al., 2016; Liang et al., 2016). Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 Bảng 2. Các trình tự DNA tương đồng với crRNA trong hệ gen lúa Tên crRNA-10 crRNA-11 Trình tự DNA tương đồng Vị trí GAGAGCAC[AGCTCGAGTCGG] GAGAGCAC[AGCTGGAGTCGG] GCGAGCGG[AGCACGAGTCGG] GGGAGGGC[AGCTGGAGTCGG] GCGAGCCG[AGCTCGGGTCGG] GGCAGCAG[AGCTCGAGGCGG] GCGAGAAG[AGCTCGAGACGG] CAGGGCAG[AGCTCGAGTCTG] GGTGGATG[TCTCGCAGGGGT] E E E E Khoảng cách đến Exon gần nhất 0 0 12291 292 0 969 4073 1239 0 Mã số gen đích Os08g0509600 (IPA1) Os09g0491532 EPlOSAG00000037716 EPlOSAG00000012530 Os02g0511400 EPlOSAG00000027300 Os05g0226900 Os12g0536300 Os08g0509600 (IPA1) Ghi chú: Chữ trong ngoặc [] thể hiện trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) của crRNA; chữ in đậm thể hiện vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng trên crRNA; E: Exon. Như vậy, hai trình tự crRNA-10 và crRNA-11 đã được chọn để sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến vùng exon III của IPA1-J02 theo cơ chế NHEJ (Nekrasov et al., 2013; Shen et al., 2014) bằng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 (Bortesi and Fischer, 2015) (Hình 3). Hình 3. Một phần kết quả giải trình tự IPA1-J02 Ghi chú: Vị trí và chiều crRNA-10, crRNA-11 được đánh dấu bằng các mũi tên. 3.3. Thiết kế T-DNA mang cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa IPA1-J02 Để thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA nhận biết IPA1-J02, đoạn DNA IPA1-gRNA1 và IPA1-gRNA2 có mang 2 đầu dính được ghép nối lần lượt vào khung vector pENTR4-gRNA (Hình 1) đã được xử lí trước với enzyme BtgZI và BsaI (Hình 4 A & B, giếng 2). Vector tái tổ hợp (gọi là pENTR/gRNAIPA1) đã được kiểm tra bằng PCR với ba cặp mồi khác nhau. Hình 4. Ghép nối IPA1-gRNA1 và IPA1-gRNA2 vào cấu trúc biểu hiện trên pENTR4/gRNA (A&B) Ghi chú: Cắt giới hạn pENTR4/gRNA bằng BtgZI (A) và BsaI; Giếng 1: Vector nguyên bản; Giếng 2: Sản phẩm cắt giới hạn. (C) Kiểm tra pENTR4/gRNA-IPA1 bằng PCR; Giếng 1 - 2: PCR với cặp mồi U6.1-F/BtgZI-IPA1-R; Giếng 3 - 4: PCR với cặp mồi BsaI-IPA1-F/Ter-R; Giếng 5 - 6: PCR với cặp mồi BtgZI-IPA1-F/BsaI-IPA1-gRNA2-R; Giếng 1, 3, 5: Đối chứng âm (không có DNA khuôn); Giếng 2, 4, 6: Khuôn là pENTR4/gRNA-IPA1. Giếng M: Thang chuẩn DNA 1 kb (iNtRon). 53 Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 Kết quả điện di cho thấy PCR với cặp mồi đặc hiệu cho cấu trúc biểu hiện IPA1-gRNA1 (U6.1–F/ BtgZI-IPA1-R), cấu trúc biểu hiện IPA1-gRNA2 (BsaI-IPA1-F/Ter–R) và đồng thời cả 2 cấu trúc biểu hiện gRNA (BtgZI-IPA1-F/BsaI-IPA1-R) đã thu được các sản phẩm có kích thước lần lượt khoảng 0,36 kb (Hình 4C, giếng 2); 0,19 kb (Hình 4C, giếng 4) và 0,44 kb (Hình 4C, giếng 6) phù hợp với kích thước theo tính toán lý thuyết của các đoạn DNA cần nhân bản. Điều này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pENTR4/gRNA-IPA1 thu được đã mang 2 trình tự IPA1-gRNA1 và IPA1-gRNA2 tại vị trí mong muốn. Đoạn DNA mang 2 cấu trúc biểu hiện gRNA (U6.1::IPA1-gRNA1 và U6.2::IPA1-gRNA2) được ghép nối vào vị trí HindIII trên vector nhị phân pCas9 mang cấu trúc biểu hiện protein Cas9 (Ubiquitin:Cas9:Nos) bằng T4 DNA ligase. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ thể biến nạp dương tính và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện 2 gRNA bằng phương pháp PCR và phương pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn HindIII. Kết quả trên hình 5A cho thấy các băng sản phẩm PCR với cặp mồi Ubi-F/ Cas9-R (đặc hiệu cho cấu trúc [Ubiquitin:Cas9]) và BtgZI-IPA1-F/BsaI-IPA1-R (đặc hiệu cho 2 trình tự crRNA chỉnh sửa IPA1-J02) có kích thước lần lượt 0,36 kb và 0,44 kb, đúng với kích thước tính toán lý thuyết. Tương tự, kết quả cắt giới hạn vector tái tổ hợp pCas9/gRNA bằng enzyme HindIII cũng thu được 2 băng DNA có kích thước đúng với tính toán lý thuyết, bao gồm băng DNA 15,8 kb và 0,94 kb tương ứng với kích thước của khung vector pCas9 và cấu trúc biểu hiện 2 gRNA (Hình 5B, giếng 4). Vector tái tổ hợp đã được giải trình tự Nu (Hình 4) để đảm bảo sự ghép nối chính xác của các cấu trúc. Các kết quả này cho phép khẳng định vector pCas9/ gRNA-IPA1 mang cấu trúc biểu hiện phức hệ chỉnh sửa IPA1-J02 đã được thiết kế thành công. Hình 5. Kiểm tra pCas9/gRNA-IPA1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn Ghi chú: (A) PCR vector tái tổ hợp; Giếng 1 - 2: PCR với cặp mồi Ubi-F/Cas9-R; Giếng 3 - 4: PCR với cặp mồi BtgZI-IPA1-F/BsaI-IPA1-R; giếng 1 và 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn); Giếng 2 và 3: Khuôn là pCas9/gRNAIPA1. (B) Cắt giới hạn vector bằng HindIII; Giếng 1 và 3: Vector nguyên bản; Giếng 2 và 4: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII; Giếng 1 và 2: pCas9; Giếng 3 và 4: pCas9/gRNA-IPA1. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb (iNtRon). Trong các nghiên cứu trước đây, cấu trúc biểu hiện sgRNA có thể được thiết kế bằng nhiều phương thức khác nhau nhưng chủ yếu là kĩ thuật overlapping-PCR. Để biểu hiện phức hệ Cas9-sgRNA trong tế bào lúa, các tác giả thường thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA điều khiển bởi promoter U3 hoặc U6 và cấu trúc biểu hiện Cas9 điều khiển bởi promoter Ubiquitin nằm trên cùng một hệ vector nhị phân nhằm thuận tiện cho bước biến nạp vào tế bào chủ. Hệ thống vector này được chứng minh là có khả năng đồng nhất, hiệu quả và tạo ra nhiều đột biến có thể di truyền (Ma et al., 2016). Trong nghiên cứu này, 2 cấu trúc biểu hiện sgRNA điều khiển bởi promoter U6 nhận biết 2 vị trí khác nhau trên vùng exon III của IPA1-J02 đã được tạo ra bằng kỹ thuật ghép nối DNA sử dụng enzyme cắt giới hạn và T4 DNA ligase. Cấu trúc [U6.1:IPA1-gRNA1]và [U6.2:IPA1-gRNA2] đã được ghép nối vào vector nhị 54 phân pCas9 mang cấu trúc [Ubiquitin:Cas9:NOS] (biểu hiện protein Cas9) để tạo ra vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc biểu hiện phức hệ proteinRNA chỉnh sửa IPA1 của giống lúa J02 theo cơ chế ghép nối NHEJ (Nekrasov et al., 2013; Shen et al., 2014). Kết quả của nghiên cứu này là tiền đề cho việc tạo ra giống lúa chất lượng J02 có năng suất cao bằng công nghệ chỉnh sửa gen. IV. KẾT LUẬN Vùng mã hóa exon III của IPA1-J02 liên quan đến các tính trạng năng suất ở giống lúa J02 đã được phân lập và giải trình tự đầy đủ để thiết kế 2 trình tự crRNA phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa gen IPA1-J02 bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Cấu trúc biểu hiện gRNA mang 2 trình tự crRNA nhận biết 2 vị trí khác nhau trên exon III của IPA1-J02 đã được đưa vào vector nhị phân pCas9. Vector pCas9/gRNA-IPA1 Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 12(121)/2020 đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt enzyme giới hạn để phục vụ nghiên cứu tăng năng suất cho giống lúa chất lượng cao J02 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bae, S., Park J. and Kim J. S., 2014. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics., 30 (10): 1473-1475. Bortesi, L. and Fischer R., 2015. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol Adv., 33 (1): 41-52. Doench, J. G., Fusi N., Sullender M., Hegde M., Vaimberg E. W., Donovan K. F., Smith I., Tothova Z., Wilen C., Orchard R., Virgin H. W., Listgarten J. and Root D. E., 2016. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Bio., 34 (2): 184-191. Doyle, J. J. and Doyle J. L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus., 12: 13-15. Fan, C., Xing Y., Mao H., Lu T., Han B., Xu C., Li X. and Zhang Q., 2006. IPA1, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein. Theor Appl Genet., 112 (6): 1164-1171. Fu, Y., Sander, J., Reyon, D., Cascio V. M. and Joung J. K., 2014. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol., 32: 279-284. Jiao, Y., Wang Y., Xue D., Wang J., Yan M., Liu G., Dong G., Zeng D., Lu Z., Zhu X., Qian Q. and Li J., 2010. Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice. Nat Genet., 42 (6): 541-544. Li, M., Li X., Zhou Z., Wu P., Fang M., Pan X., Lin Q., Luo W., Wu G. and Li H., 2016. Reassessment of the Four Yield-related Genes Gn1a, DEP1, IPA1, and IPA1 in Rice Using a CRISPR/Cas9 System. Front Plant Sci., 7: 377. Liang, G., Zhang H., Lou D. and Yu D., 2016. Selection of highly efficient scrRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Sci Rep., 6: 21451. Ma, X., Zhu Q., Chen Y., and Liu Y. G., 2016. CRISPR/ Cas9 platforms for genome editing in plants: Developments and applications. Molecular Plant., 9 (7): 961-974. Mao, H., Sun S., Yao J., Wang C., Yu S., Xu C., Li X. and Zhang Q., 2010. Linking differential domain functions of the IPA1 protein to natural variation of grain size in rice. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 107 (45): 19579-19584. Miura, K., Ikeda M., Matsubara A., Song X. J., Ito M., Asano K., Matsuoka., Kitano H., and Ashikari M., 2010. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice. Nat Genet., 42 (6): 545-549. Nekrasov, V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J. D. and Kamoun S., 2013. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol., 31 (8): 691-693. Sambrook, J. and Russel D. W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour: NY. Shen, B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X. and Skarnes W. C., 2014. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods., 11 (4): 399-402. Shen, L., Wang C., Fu Y., Wang J., Liu Q., Zhang X., Yan C., Qian Q. and Wang K., 2018. QTL editing confers opposing yield performance in different rice varieties. J Integr Plant Biol., 60 (2): 89-93. Smith, L. M., Sanders J. Z., Kaiser R. J., Hughes P., Dodd C., Connell C. R., Heiner C., Kent S. B. and Hood L. E., 1986. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 321 (6071): 674-679. Designing a T-DNA for editting IPA1 gene related to yield trait of J02 rice variety Phung Thi Thu Huong, Pham Thu Hang, Cao Le Quyen, Pham Xuan Hoi, Nguyen Duy Phuong Abstract With the aim of further improving the yield of high quality rice variety J02, the study focused on the isolation and sequencing of the exon III region of IPA1-J02 related to traits for yield in rice variety J02, design crRNA sequences for modification of IPA1-J02 and design T-DNA containing sgRNA expression structure for modification of IPA1-J02. The results showed that sgRNA expression constructs carrying two crRNA sequences recognizing two different positions on exon III of IPA1-J02 was inserted into binary vector pCas9. Binary vector pCas9/gRNA-IPA1 was tested by PCR and restriction for future use of generating the yield-improved high-quality J02 rice variety using gene editing technology. Keywords: Gene editing, yield, CRISPR/CAS9, IPA1, mutation Ngày nhận bài: 06/9/2020 Ngày phản biện: 21/9/2020 Người phản biện: GS.TS. Phạm Văn Toản Ngày duyệt đăng: 02/10/2020 55
This site is protected by reCAPTCHA and the Google Privacy Policy and Terms of Service apply.