Nội dung

Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, số 3/2015 PHÁT HIỆN NHANH BÀO TỬ VI KHUẨN BACILLUS ANTHRACIS BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Đến tòa soạn 30 – 12 - 2014 Hoàng Thế Yên, Lê Trọng Văn, Nguyễn Thị Nga, Trần Minh Trí, Nguyễn Thành Đạt Viện Kỹ thuật Hóa - Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật, Bộ Công an Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Bùi Phương Thuận Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà nội SUMMARY RAPID DETECTION OF BACILLUS ANTHRACIS SPORES BY IMMUNOCHROMATOGRAPHY METHOD Anthrax in human and animal caused by Bacillus anthracis . It is a dangerous disease. B. Anthracis spores may be using in bioterrorism and bioweapons. Therefore, there is an urgent need for convenient, sensitive, and specific methods to detect the spores of B. Anthracis. This article reports an immunochromatography device based on the principle of sandwich assay (lateral flow test). This test were developed by using monoclonal anti – B. Anthracis spores SA26 and SA27. The spores captured by a monoclonal anti-spore antibody gold conjugated (SA27) in the conjugate pad. This complex will was captured by other monoclonal anti – spore (SA26) coated on the nitrocellulose membrane (sanwhich assay), so T line appear . The solution migrates by capillary action through the test strip. This complex was captured by goat anti – mouse IgG antibody, C line appear. If it was negative (without spores in sample), the T line disappeared. If it was positive (with spores), the T line developed in the T region. This method had high sensitivity and specificity. Result was read rapidly. We chose several appropriate conditions as: concentration of capture reagents on test line and control line, concentration of colloidal conjugated gold on the conjugate pad, treated sample pad, sample extract buffer to make a rapid test. We successfully created a rapid test to detect Bacillus anthracis spores. The limit of detection of spores is 10 5 spores/ml. Reading results are set at 15 minutes. Sensitivity is 100% and specificity is 97%. This device is simple and activites in the field. Store the test below room temperature. Keywords: Capture reagents, Bacillus anthracis, rapid test, spores, lateral flow test. 1 1.ĐẶT VẤN ĐỀ quả xét nghiệm nhanh, đơn giản và giá Vi khuẩn Bacillus anthracis là tác nhân gây thành thấp. Kỹ thuật này sử dụng các chất bệnh than ở người và động vật, thuộc nhóm tạo màu như keo vàng, hạt nano bạc, hạt vi khuẩn Gram dương có khả năng hình latex, trong đó hạt nano vàng được sử dụng thành bào tử. Trong điều kiện bất lợi về phổ biến nhất tiếp đến là hạt latex dinh dưỡng, B. anthracis thúc đẩy quá trình (Posthuma-Trumpie et al., 2009), ngoài ra hình thành bào tử để chống chọi với điều còn hạt từ tính (Lui et al., 2011). kiện môi trường trong thời gian dài, bao Để phát hiện bào tử vi khuẩn than bằng kỹ gồm nhiệt độ cao, chiếu xạ liều cao, tác thuật miễn dịch trên màng, các hãng thương động bởi hóa chất và thậm chí là chân mại đang cung cấp hai kháng thể đơn dòng không ngoài không gian (Nicholson et al., SA26 và SA27, được cho là kháng thể khá 2000). Vì vậy, B. anthracis được liệt kê vào đặc hiệu với kháng nguyên vỏ bào tử vi danh mục A vũ khí sinh học nguy hiểm bởi khuẩn B. anthracis. Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng của Hoa Kỳ. Các sự kiện khủng bố sinh học hai kháng thể đơn dòng kháng vỏ bào tử vi sảy ra năm 2001 là minh chứng rõ nhất về khuẩn B. anthracis SA26 và SA27 để chế mối đe dọa của B. anthracis đến sức khỏe tạo que thử nhanh phát hiện bào tử vi khuẩn cộng đồng. Gần đây, các nhà khoa học trên B. anthracis phục vụ công tác phát hiện thế giới đã rất quan tâm và phát triển nhiều nhanh ngoài hiện trường không cần các phương pháp khác nhau để phát hiện nhanh thiết bị phụ trợ của phòng thí nghiệm. bào tử vi khuẩn than. Các kỹ thuật khác 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP nhau để phát hiện bào tử vi khuẩn than bao NGHIÊN CỨU gồm kỹ thuật miễn dịch (Mechaly et al, Nguyên liệu và hóa chất 2008), kỹ thuật PCR (Skottman et al., Chủng vi khuẩn B. subtilis, B. ceures, B. 2007), hệ thống nhận biết sensor (Garcia- thurigencis, B. anthracis chủng nhược độc Aljaro et al., 2010) và một số phương pháp từ phòng thí nghiệm an toàn cấp 3 – Bộ khác (Tan et al., 2011; Oh et al., 2011). công an. Kháng thể đơn dòng SA26 và Các kỹ thuật trên đa phần đòi hỏi phải đi SA27 kháng vỏ bào tử vi khuẩn than của kèm các thiết bị đắt tiền và thao tác phức hãng Abcam (Mỹ). Kháng thể đa dòng goat tạp. anti-mouse của hãng Arista (Mỹ). Màng Từ những năm 1990, kỹ thuật phản ứng nitrocellulose của hãng MDI. Hóa chất sử miễn dịch trên màng được sử dụng rất rộng dụng cho các đệm mua của Sigma, Merck. rãi để phát hiện các loại bệnh truyền nhiễm, Các loại nguyên liệu: màng PE phức hợp, các chất gây nghiện, hoặc các chất phân chất bảo quản, và một số nguyên liệu trong tích trong môi trường có hàm lượng phấp nước. mà không cần các thiết bị phụ trợ của C10066 hãng HAMAMATSU Nhật Bản. phòng thí nghiệm. Đây là kỹ thuật cho kết 2 Máy Immunochromato Reader Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong chế tạo phát hiện nhanh theo bản quyền công nitrocellulose và chọn tỷ lệ phù hợp nhất nghệ của hãng Arista (Mỹ). Cụ thể cần phải tiến hành lần lượt các nghiên cứu sau: Phương pháp xây dựng qui trình chế tạo que thử Trên cơ sở các số liệu nghiên cứu, tối ưu và các nguyên liệu phù hợp đã lựa chọn để xây Phương pháp thử nghiệm lựa chọn nguyên liệu phù hợp Các nguyên liệu sử dụng trong chế tạo có nhiều loại, nhiều nguồn gốc và tính năng kỹ bằng cách so sánh cường độ biểu hiện màu trên hai vạch T và vạch C. dựng qui trình chế tạo que thử phát hiện bào tử than với hệ thống thiết bị ở qui mô thuật khác nhau. Mỗi loại que thử xác định cần phải tiến hành thử nghiệm để chọn phòng thí nghiệm. được các loại nguyên liệu phù hợp. Bên cạnh đó với mỗi loại màng cần phải xử lý của que thử Giới hạn phát hiện: Bào tử vi khuẩn có mật bằng đệm trước khi đưa kháng thể lên. Hệ đệm và quy trình xử lý riêng cho mỗi loại độ được xác định bằng phương pháp pha loãng, cấy gạt và đếm khuẩn lạc trên môi màng cũng cần phải xác lập (Jemo, 1996). trường thạch. Xác định ngưỡng của que thử là mật độ bào tử thấp nhất mà que cho kết Phương pháp tối ưu các sinh phẩm trải Phương pháp xác định thông số kỹ thuật trên màng Tối ưu hóa nồng độ chất bắt giữ tại vạch T và vạch C: Chất bắt giữ tại vạch C được pha quả dương tính (xuất hiện hai vạch T và C). trong đệm phosphate buffer saline (PBS) 10 mM có pH 7,4 (Jemo, Byungwoo 1996) với tế nhất định trên các mẫu giả định để xác định khả năng cho âm tính giả và dương nồng độ khác nhau 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/ml. Chất bắt giữ tại vạch T cũng được pha trong tính giả. Kết quả được tính ra tỷ lệ phần trăm. hệ đệm PBS có nồng độ 0.1M pH 7,4 thành các nồng độ khác nhau; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 Xác định khả năng phản ứng chéo: Que thử được kiểm tra với một số bào tử vi khuẩn mg/ml. Màng sau khi trải sinh phẩm lên trên sẽ được khóa các liên kết không đặc hiệu B. subtilis, B. ceures, B. thurigencis để xác định khả năng phản ứng chéo. bằng dung dịch block phosphat buffer saline bổ sung bovine serum abumine (Fishers, 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1998). Kết quả được xác định bằng cường độ vạch màu trên màng nitrocellulose tại vạch T T và C Kháng thể goat anti-mouse nồng độ và vạch C. Tối ưu hóa lượng kháng thể cộng hợp vàng: 7.83 mg/ml pha trong đệm PBS thành các nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/ml sử dụng Lượng kháng thể trên màng mang chất cộng hợp vàng được xác định bằng cách máy chuyên dụng trải lên vạch C của màng nitrocellulose. Kháng thể đơn dòng kháng pha loãng ở các tỷ lệ khác nhau, thử nghiệm phản ứng miễn dịch kháng nguyên vỏ bào tử vi khuẩn SA26 có nồng độ 2mg/ml được pha loãng thành các nồng độ với kháng thể đặc hiệu trên màng 0,3; 0,5; 0,7; 0,9/mg/ml trong đệm PBS 7,4, Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu: Phép thử được lặp đi lặp lại số lượng mẫu thực Tối ưu hóa nồng độ chất bắt giữ tại vạch 3 được đưa lên màng tại vị trí vạch T. Sau khi Các màng được lắp ráp theo trình tự để đưa hai sinh phẩm lên màng nitrocellulose, màng sẽ được ủ qua đệm tại nhiệt độ 370C, tạo test và thử nghiệm với dịch chứa bào tử ở mật độ 106 bào tử/ ml. độ ẩm 10%. Kháng thể đơn dòng SA27 được cộng Kết quả trên (Hình 1) cho thấy, nồng độ chất bắt giữ tại vạch T và vạch C trong hợp hạt vàng kích thước nano theo phương pháp của Slot và Geuze 1985. Sau khi cộng khoảng 0,9 và 0,7 mg/ml cho kết quả hiện hai vạch T và vạch C là tốt nhất, thể hiện rõ hợp được pha loãng tỷ lệ 1:10. Đây là tỷ lệ pha loãng đảm bảo lượng kháng thể cộng nét. Ở các nồng độ cao hơn là không cần thiết vì lượng nhiều hơn sẽ gây lãng phí hợp vàng luôn thừa trong phản ứng miễn dịch trên màng. kháng thể không cần thiết. Chúng tôi chọn nồng độ 0,7 mg/ml. A B C D Hình 1. Nồng độ chất bắt giữ vạch tại T và C. A. 0,9 mg/ml; B. 0,7 mg/ml; 0C. 0,5 mg/ml; D. 0,3 mg/ml. A B C Hình 2: Biểu đồ peak chất bắt giữ tại vạch C và T đọc trên máy Immunochromato Reader C10066 D A. 0,9 mg/ml; B. 0,7 mg/ml; C. 0,5 mg/ml; D. 0,3 mg/ml. SDS 0,001%. Sấy khô. Hoàn thiện que thử sau đó thử với mẫu. Các màng được lắp ráp Tối ưu hóa nồng độ kháng thể đơn dòng theo trình tự để tạo test và thử nghiệm với cộng hợp vàng Kháng thể SA27 cộng hợp hạt vàng dung dịch chứa bào tử mật độ 106 bào tử/ml. kích thước nano được pha trong đệm PBS có pH 7,4 có tỷ lệ pha loãng khác nhau: (1 : Trong các tỷ lệ pha loãng (Hình 3) chúng tôi chọn tỷ lệ (1:15) cho chất cộng hợp. Các 10); (1 :15); (1 : 20); (1 :25); (1 :30). Dùng máy trải mỗi tỷ lệ lên một đoạn màng chứa tỷ lệ thấp hơn đều không đảm bảo lượng vàng trên hai vạch T và vạch C. Các tỷ lệ chất cộng hợp. Sấy và bảo quản tránh ẩm và ánh sáng. Màng hút mẫu được xử lý cao hơn cho thấy không cần thiết hai vạch T và C không rõ nét hơn và hóa chất sử bằng đệm PBS 0.01M có pH 8,6 bổ sung dụng nhiều hơn. 4 A B C D E Hình 3. Tỷ lệ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu cho que thử bào tử B.anthracis. A. (1:10); B. (1 :15); C. (1:20); D. (1 :25); E. (1 :30). Xác định giới hạn phát hiện của test Trong đó mẫu M1 là mẫu nước cất 2 lần, M2 đến M7 có mật độ bào tử khác nhau. có mật độ 106 bào tử/ml. Một số mẫu bột Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tại mẫu đối chứng và mẫu M2 các que thử đều cho kết Công thức tính độ nhạy: Số mẫu dương tính thật quả âm tính, tại mật độ 104 bào tử/ml có 1 phép thử cho kết quả xuất hiện vạch T Độ nhạy = -------------- x 100 Số mẫu dương tính thật + Số mẫu âm tính giả nhưng không rõ nét nên tạm đọc là dương tính, các que thử còn lại không xuất hiện Công thức tính độ đặc hiệu: Số mẫu âm tính thật vạch T. Tại mật độ 105 đến 108 bào tử/ml, kết quả Độ đặc hiệu = ---- x 100 Số mẫu âm tính thật + Số mẫu dương tính giả cho thấy 100% xuất hiện vạch T trên que thử. Như vậy, giới hạn phát hiện của que Số liệu ở (Bảng 2) cho thấy Độ nhạy = 100/ [(100 + 0)] x 100 = 100% thử được xác định là 105 bào tử/ml. Độ đặc hiệu = 97/ [(97 + 3)] x 100 = 97%. Kết quả trên cho thấy, độ nhạy của test đạt giống các mẫu bột ở hiện trường cũng được thử nghiệm như: bột gạo, bột sắn, bột đất. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu Mẫu bào tử vi khuẩn B. subtilis, B. ceures, B. thurigencis, B. anthracis được chuẩn bị 100% còn độ đặc hiệu là 97%. Bảng 1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của test. Mẫu Mật độ bào tử (bào tử/ml) Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Test 5 Test 6 M1 0 - - - - - - M2 103 - - - - - - M3 104 - - - + - - M4 105 + + + + + + M5 106 + + + + + + M6 107 + + + + + + M7 108 + + + + + + 5 Bảng 2. Kết quả xác định mức độ dương TÀI LIỆU THAM KHẢO tính giả và âm tính giả. Mẫu Fishers, Kết quả Số lần thử Dương tính Âm tính Lateral Flow or Strip Tests Development Ideas”. Provided by Bangs Laboratories Inc. 0 9025 Technology Drive, IN 46038-7034: 3-5. Jemo K, et al., (1996) “Immunoassay Bào tử B.anthracis 10 bào tử/ml 5 100 100 Mẫu đối chứng âm 100 3 97 Tổng 200 103 97 Bảng 3. Phản ứng chéo của que thử đối với một số bào tử vi khuẩn khác. Mẫu Kết quả ở các lần lặp lại B. ceures 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - B. subtilis - - - - - - - B. thrugiencis - - - - - - - B. anthracis Bột gạo + - + + - - + - + - + - + - Bột đất Bột mì - - - - - - devices and materials” United States Patent. Patent No US 5,559,041. Mechaly A., et al., (2008)“Development and Implementation of a Single-Chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores”. Appl. Environ. Microbiol. 74, 18-822. Nazareth, (2001) “Diagnostic detection device and method”. United States Patent. Patent No US 6,319,676 B1. Nicholson W.L., et al., (2000) “Resistance - KẾT LUẬN Qua nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi đã tối ưu và lựa chọn được nồng độ kháng thể tại hai vạch C và T là 0,7 mg/ml, tỷ lệ pha loãng kháng thể cộng hợp màu 1:15 và nguyên liệu phù hợp cho việc chế tạo. Đã tạo thành công que thử nhanh bào tử B. anthracis với giới hạn phát hiện 105 bào tử/ml, có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 97%, thời gian phát hiện 15 phút. Lời cảm ơn: Nhóm đề tài xin chân thành cảm ơn Chương trình đề tài liên Bộ giữa Bộ công an và Bộ Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ kinh phí để chúng tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu của đề tài. of Bacillus terrestrial endospores to extreme and extraterrestrial environments”. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 548–572. Liu C., et al., (2011) “Lateral flow immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle aggregates as color reagents”. Ana. Chem 83, 6778–6784. Oh W.K., et al., (2011) (2009). “Fluorescent europium-modified polymer nanoparticles for rapid and sensitive anthrax sensors”. Biosensors Bioelectronics 29, 172–177. & Posthuma-Trumpie G.A., et al.,, “Lateral flow (immuno) assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey”. Analytical and Bioanalytical Chemistry 393, 569–582. Skottman T., et al., (2007) “Simultaneous real-time 6 (1998).“Immunochromatographic, PCR detection of Bacillus and labeling cytochemistry”. Eur. J. Cell. Biol. Yersinia pestis”. Eur. J. Infec Diseases 26, 207–211. 38, 87-93. Tan C., et al., (2011) “Optical and Garcia-Aljaro C., et al., (2010) “Carbon nanotubes-based chemiresistive biosensors Electrochemical Responses of an Anthrax Biomarker Based on Single-Walled Carbon for detection of Microorganisms”. Biosensors & Bioelectronics 25, 2309– Nanotubes Terbium 2312. Slot JW, Geuze HJ (1985) “A new method Communications anthracis, Francisella tularensis Covalently Loaded with Complexes”. Chemical 47, 12521–12523. of preparing gold probes for multiple- ____________________________________________________________________________ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH….. (tiêp theo tr. 13) 4. KẾT LUẬN 2.José A.Gásquez, Điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc là một phương pháp phân Roberto A. Olsina, Luis D. Martinez, Miguel de la Guardia, Talanta, 67, 824- tích mới với độ nhạy và độ chọn lọc tương đối tốt. 828. 3.N.M.P. Kỹ thuật này cho phép tách và định lượng đồng thời các NTĐH nhóm nhẹ trong dung Shihomatsu, L.B. Zinner, P. (2005), Miranda Jr, Journal of Alloys and dịch một cách thuận lợi và thu được kết quả Compounds 249, 133- 135. chính xác với độ tin cậy cao. Hy vọng kết quả khả quan này sẽ mở ra hướng nghiên 4.Surendra P.Verma, Roberto Garcia, Edgar Santoyo, Alfredo Aparicio, (2000), cứu tiếp theo với các NTĐH nhóm nặng, nhằm phát huy vai trò của phương pháp Journal of Chromatography A. 884 , 317328. điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) trong lĩnh vực 5.Yanbei Zhu, Akihide Itoh, Eiji Fujimori, Tomonari Umemura, Hiroki Haraguchi, phân tích các nguyên tố đất hiếm. (2006), Journal of Alloys and Compounds, 408- 412, 985- 988. Moraes, Edmilson H.M. DeLima, (1997), TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Andreas J. Zemann, (2001), Conductivity detection in capillary electrophoresis, Trends in analytical chemistry, vol. 20, No 6 +7. 7