Nội dung

UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION VOL.3, NO.2 (2013) NGHIÊN CỨU MỘT SỐ NHÓM VI SINH VẬT PHÂN GIẢI TINH BỘT TRONG AO NUÔI TÔM Ở ĐẦM SAM - CHUỒN, PHÚ VANG, THỪA THIÊN HUẾ RESEARCHING ON SOME GROUPS OF STARCH - DEGRADING MICROORGANISMS IN SHRIMP CULTURE PONDS AT SAM - CHUON LAGOON, PHU VANG DISTRICT, THUA THIEN HUE PROVINCE Phạm Thị Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Hoàng Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Email: Ngoclanz@yahoo.com TÓM TẮT Hiện nay chất lượng nước tại các ao nuôi tôm ở vùng đầm phá Tam Giang - Cầu Hai đang giảm sút nghiêm trọng. Do đó việc đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ cao, đồng thời tạo các chế phẩm để xử lý ao nuôi là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Từ các mẫu bùn ao nuôi tôm, đã phân lập tuyển chọn và tuyển chọn được chủng vi khuẩn V94 và chủng xạ khuẩn X65 có khả năng phân giải tinh bột mạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian nuôi cấy tối ưu đối với chủng V94 là 72 giờ và chủng X65 là 108 giờ, hai chủng này sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ trung tính đến kiềm yếu, nhiệt độ 30 - 35 0C và nồng độ muối NaCl 0,5 - 15‰. Hai chủng này còn có khả năng phân giải mạnh đối với protein, cellulose và lipid. Đặc biệt hơn, chủng X65 có khả năng kháng với cả 5 loại vi sinh vật kiểm định, trong đó kháng mạnh với 2 đối tượng gây bệnh cho tôm là Vibrio sp. và Vibrio parahaemolyticus. Từ khóa: vi sinh vật, tinh bột, bản địa, Phú Vang ABSTRACT Currently, the water quality at many shrimp ponds in Tam Giang-Cau Hai lagoon is being declined. Thus, assessing and selecting the indigenous microorganisms with high ability to degrade organic materials as well as the production of bio-preparations for treating shrimp ponds possess a practical and scientific significance. From some sludge samples of many shrimp ponds, we isolated V94 bacterial strain and X65 actinomycetes strain having high ability to degrade starch. Results showed that the optimal growth times for V94 and X65 were 72 and 108 hrs, respectively; the pH, temperature and concentration of NaCl for their optimal growth were neutral to low pH, 30-350C and 0,5 15‰, respectively. Both strains also had the ability to strongly degrade protein, cellulose and lipid. Moreover, X65 strain had the ability of antibacterian to 5 microorganisms especially two shrimps pathogens, Vibrio sp. and Vibrio parahaemolyticus. Key words: microorganism; starch; indigenous; Phu Vang 1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, nghề nuôi tôm ở đầm phá Tam Giang - Cầu Hai phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các vùng ao nuôi thuộc đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế. Hiện trạng môi trường nước trong các ao nuôi này ngày càng ô nhiễm nặng do một số nguyên nhân chính như lượng thức ăn dư thừa quá nhiều, thời gian thay nước không hợp lý và tôm chết do dịch bệnh [1]. Điều này không những tác động tiêu cực đến năng suất thu hoạch mà còn gây ra những ảnh hưởng xấu cho môi trường sinh thái. Do đó phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nguồn nước có ý nghĩa rất lớn trong hướng nghiên cứu về môi trường và phát triển bền vững. Đồng thời đây là cơ sở cho việc sản xuất các chế phẩm vi sinh bản 12 địa làm sạch ao nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường [2], [3], [4]. 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải tinh bột được phân lập từ bùn ao nuôi tôm ở đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế. Các vi sinh vật kiểm định: Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio sp. và Vibrio parahaemolyticus. 2.2. Phương pháp nghiên cứu * Xác định hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch - Nguyên tắc: Enzyme phản ứng với cơ chất trong môi trường thạch làm cho môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC TẬP 3, SỐ 2 (2013) phản ánh hoạt tính của enzyme. Methyl Cellulose) và dầu nành. - Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dịch thể để thu dịch lọc enzyme. Chuẩn bị môi trường thạch – tinh bột để tạo giếng enzyme. Sau khi ủ dịch enzyme ở nhiệt độ 300C trong thời gian 72 giờ, tiến hành nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải tinh bột [5]. Khả năng kháng khuẩn: Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật, thu dịch lọc để kiểm tra khả năng kháng khuẩn. Môi trường kiểm định sau khi khử trùng và để nguội đến khoảng 450C, cho vi sinh vật kiểm định vào rồi phân đều vào các đĩa petri. Khi thạch nguội, tạo giếng, nhỏ dịch lọc kiểm tra vào, đặt lạnh 40C từ 3 -5 giờ, rồi nuôi ở 300C sau 12 - 24 giờ, xác định hiệu số vòng vô khuẩn. * Thăm dò ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính của amylase và sự tích lũy sinh khối của các chủng vi sinh vật Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đã được tuyển chọn trong môi trường dịch thể tương ứng (môi trường Vinogradski đối với chủng V94 và môi trường Gause I đối với chủng X65) với nguồn carbon được thay bằng tinh bột trong các điều kiện thời gian, pH môi trường, nhiệt độ và nồng độ muối NaCl khác nhau. Sau khi nuôi cấy, ly tâm tách riêng phần dịch lọc và sinh khối. Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và xác định sinh khối theo phương pháp cân. * Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi sinh vật Khả năng phân giải protein, celllulose và lipid: Tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Khảo sát với protein, thay nguồn nitrogen bằng casein với cellulose và lipid, thay nguồn carbon tương ứng bằng CMC (Carboxyl 3. Kết quả và biện luận 3.1 Tuyển chọn Với 206 chủng vi khuẩn và 96 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải tinh bột phân lập được từ những mẫu bùn trong các ao nuôi tôm ở đầm Sam - Chuồn, chúng tôi tiến hành tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, kết quả thu được chủng vi khuẩn V94 và chủng xạ khuẩn X65 có hoạt tính amylase mạnh nhất. Hai chủng này được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn V94 và chủng xạ khuẩn X65 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dịch thể tương ứng với các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó xác định hoạt tính amylase và sinh khối khô. Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng V94 và X65 Thời gian (giờ) 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Chủng V94 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) D - d (mm) SKK (mg/ml) 26,00 + 0,33 28,50 + 0,00 30,00 + 0,33 33,00 + 0,67 34,00 + 0,00 25,00 + 0,33 23,50 + 0,67 19,50 + 0,33 16,50 + 0,67 13,50 + 0,67 9,63 + 0,22 12,67 + 0,30 16,28 + 0,12 18,37 + 0,24 20,68 + 0,50 19,14 + 0,21 16,95 + 0,20 15,05 + 0,12 14,34 + 0,14 12,46 + 0,14 15,00 + 0,33 17,50 + 0,00 19,00 + 0,33 21,00 + 0,33 22,00 + 0,00 24,00 + 0,00 29,00 + 0,67 35,00 + 0,33 30,50 + 0,67 25,00 + 0,67 3,23 + 0,12 4,49 + 0,21 5,22 + 0,11 5,50 + 0,10 6,43 + 0,13 7,81 + 0,16 8,17 + 0,12 8,79 + 0,12 8,41 + 0,17 7,83 + 0,13 ("D -d": đường kính vòng phân giải, "SKK": sinh khối khô) 13 UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION Kết quả thu được cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu của chủng V94 là 72 giờ và chủng X65 là 108 giờ. Tốc độ sinh trưởng và sinh khối cực đại của chủng V94 cao hơn hẳn so với chủng X65. Tuy nhiên chủng X65 lại cho hoạt tính amylase mạnh hơn. VOL.3, NO.2 (2013) 3.2.2. Ảnh hưởng của pH môi trường Chủng V94 và X65 được nuôi cấy trong môi trường dịch thể tương ứng với các mức pH khác nhau. Hoạt tính amylase và sinh khối khô được thể hiện ở Bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng V94 và X65 pH 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Chủng V94 D - d (mm) SKK (mg/ml) 19,50 + 0,67 6,28 + 0,12 24,00 + 0,67 13,01 + 0,25 32,00 + 0,33 19,69 + 0,18 36,50 + 0,00 21,09 + 0,17 34,50 + 0,33 20,45 + 0,16 28,00 + 0,00 17,04 + 0,13 21,50 + 0,67 10,45 + 0,18 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) 19,50 + 0,67 4,22 + 0,13 24,00 + 0,67 6,84 + 0,13 36,00 + 0,67 8,94 + 0,15 29,50 + 0,00 8,41 + 0,11 20,00 + 0,33 7.38 + 0,16 17,50 + 0,67 6,23 + 0,18 14,50 + 0,33 4,34 + 0,21 ("D -d": đường kính vòng phân giải, "SKK": sinh khối khô) Kết quả ở Bảng 2 cho thấy pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phân giải tinh bột của chủng V94 là pH 7,5 và chủng X65 là pH 7,0. Cả 2 chủng này đều thích hợp với khoảng pH từ trung tính đến kiềm, chủng V94 ưa kiềm hơn so với chủng X65. Mặt khác, trong khoảng pH khảo sát cả 2 chủng đều sinh trưởng tốt, phổ thích nghi rộng cho phép chúng thể hiện khả năng phân giải tinh bột ở các ao nuôi với các điều kiện pH khác nhau. 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Tiến hành nuôi cấy tĩnh chủng V94 và X65 trong môi trường dịch thể tương ứng với các mức nhiệt độ từ 200C đến 400C. Sau đó xác định hoạt tính amylase và sinh khối khô. Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng V94 và X65 Nhiệt độ (0C) 20 25 30 35 40 Chủng V94 Chủng X65 D-d SKK (mg/ml) D - d (mm) SKK (mg/ml) 15,50 + 4,43 + 0,10 14,00 + 1,54 + 0,11 (mm) 18,00 + 5,27 + 0,17 17,00 + 2,62 + 0,11 0,33 0,67 25,00 + 7,54 + 0,13 24,00 + 4,39 + 0,16 0,00 0,00 23,50 + 8,27 + 0,12 26,00 + 3,83 + 0,10 0,00 0,00 16,50 + 4,64 + 0,21 19,50 + 2,78 + 0,15 0,67 0,67 0,33 0,33sinh khối khô) ("D -d": đường kính vòng phân giải, "SKK": Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn V94 tích lũy sinh khối mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi cấy 350C và chủng X65 là 300C, cả 2 chủng này đều thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme amylase mạnh trong khoảng nhiệt độ 30 - 350C. 3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dịch thể tương ứng với các nồng độ NaCl khác nhau, sau đó xác định hoạt tính amylase và sinh khối khô. Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng V94 và X65 Nồng độ NaCl (‰) 0,5 5 14 Chủng V94 D - d (mm) SKK (mg/ml) 35,00 + 0,33 21,09 + 0,12 36,00 + 0,00 21,45 + 0,11 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) 33,50 + 0,33 8,89 + 0,14 34,50 + 0,33 9,61 + 0,18 TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC 10 15 20 25 30 37,00 + 0,33 34,50 + 0,67 28,50 + 0,00 25,00 + 0,33 20,50 + 0,33 TẬP 3, SỐ 2 (2013) 20,24 + 0,10 15,44 + 0,35 11,13 + 0,28 7,55 + 0,28 2,37 + 0,23 35,00 + 0,00 36,00 + 0,33 25,00 + 0,67 21,00 + 0,00 18,50 + 0,33 10,24 + 0,12 8,39 + 0,14 6,85 + 0,13 5,72 + 0,13 4,87 + 0,16 ("D -d": đường kính vòng phân giải, "SKK": sinh khối khô) X65 V94 Hình 1. Vòng phân giải tinh bột của dịch enzyme amylase tách từ chủng V94 và X65 nuôi cấy trong điều kiện tối ưu Kết quả cho thấy 2 chủng V94 và X65 thích nghi với khoảng nồng độ muối NaCl khá rộng khoảng 0,5 - 15‰. Ở nồng độ muối cao 20 - 30‰ cả hai chủng vẫn có khả năng sinh trưởng, phát triển và thể hiện hoạt tính amylase khá mạnh. Đây là ưu điểm nổi trội của chủng giống để chúng thể hiện khả năng phân giải tinh bột khi sử dụng làm chế phẩm xử lý ao nuôi. 3.2.5. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật - Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ Tiến hành nuôi cấy để thăm dò khả năng phân giải protein, cellulose và lipid của chủng V94 và X65 bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Kết quả được thể hiện qua Bảng 5 và Hình 2 dưới đây. Bảng 5. Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của chủng V94 và X65 Cơ Chất Protein Cellulose Lipid Chủng V94 KTVPG (mm) ĐKVPG (mm) 27,00 + 0,33 23,50 + 0,00 28,00 + 0,00 35,00 + 0,33 39,00 + 0,67 35,00 + 0,33 Chủng X65 KTVPG (mm) ĐKVPG (mm) 30,00 + 0,00 22,50 + 0,33 24,00 + 0,67 28,00 + 0,67 22,00 + 0,33 23,50 + 0,33 (KTVPG: kích thước vạch phân giải, ĐKVPG: đường kính vòng phân giải) Kết quả cho thấy, 2 chủng V94 và X65 ngoài khả năng phân giải tinh bột mạnh, chúng còn có khả năng phân giải mạnh các nguồn cơ chất protein, cellulose và lipid. Khả năng phân giải mạnh với nhiều chất hữu cơ khác nhau của 2 chủng này là một lợi thế rất lớn trong việc tạo chế phẩm xử lý ô nhiễm ao nuôi tôm. V9 V9 4 Pr otein 4 Cellul ose V9 4 Lip id X6 X6 X6 5 5 5 Hình 2. Vòng phân giải protein, cellulose và lipid của dịch enzyme tách từ chủng V94 và X65 15 UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION - Khả năng kháng khuẩn Tiến hành thăm dò khả năng kháng khuẩn của chủng V94 và X65 đối với 5 loại vi sinh vật VOL.3, NO.2 (2013) kiểm định gồm B. pumilus, S. aureus, E. coli, Vibrio sp. và V. parahaemolyticus. Kết quả được thể hiện qua Bảng 6 và Hình 3 dưới đây. Bảng 6. Khả năng kháng khuẩn của chủng V94 và X65 đối với các vi sinh vật kiểm định Hiệu số vòng vô khuẩn (mm) Chủng V94 Chủng X65 0,00 22,00 + 0,33 0,00 23,00 + 0,00 0,00 27,00 + 0,67 0,00 24,50 + 0,33 0,00 29,50 + 0,33 Vi sinh vật kiểm định B. pumilus (G+) S. aureus (G+) E. coli (G-) Vibrio sp. (G-) V. parahaemolyticus (G-) Vibrio sp. Vibrio parahaemolytic us Hình 3. Vòng vô khuẩn của dịch nuôi cấy chủng X65 đối với Vibrio sp. và V. parahaemolyticus Các thí nghiệm thăm dò bước đầu cho thấy, chủng vi khuẩn V94 không có khả năng kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định, trong khi đó chủng xạ khuẩn X65 lại có khả năng kháng với cả 5 loại vi sinh vật kiểm định, đặc biệt là kháng mạnh với 2 đối tượng gây bệnh cho tôm là Vibrio sp. và V. parahaemolyticus. 4. Kết luận - Hai chủng vi khuẩn V94 và xạ khuẩn X65 có khả năng phân giải tinh bột mạnh được phân lập từ bùn ao nuôi tôm ở đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế. - Thời gian nuôi cấy tối ưu đối với chủng V94 là 72 giờ và chủng X65 là 108 giờ. Hai chủng này sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ trung tính đến kiềm yếu, nhiệt độ 30 - 350C, nồng độ NaCl tối thích 0,5 - 15 ‰. - Hai chủng V94 và X65 có khả năng phân giải mạnh protein, cellulose và lipid. Chủng X65 có khả năng kháng với 5 loại vi sinh vật kiểm định, đặc biệt kháng mạnh với 2 chủng Vibrio gây bệnh cho tôm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyen Van Hop, Hoang Thai Long, Nguyen Hai Phong, Thuy Chau To (2005), Water quality of Tam Giang Cau Hai Lagoon: status, concerns and control solution, Proceedings of National Conference on Thua Thien Hue lagoon, Ministry of Science and Technology and Thua Thien Hue people's Committee: 231 - 245. [2] Ngô Thị Tường Châu, Nguyễn Ngọc Thanh (2007), Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nuôi tôm ở Thừa Thiên Huế, Hội nghị Khoa học Quốc gia về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 333 - 338. [3] Phạm Thị Ngọc Lan, Nguyễn Công Minh (2005), Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến hoạt động phân giải protein của vi khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm ở phá Tam Giang - Cầu Hai, tỉnh Thừa Thiên Huế, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 1117 – 1120. [4] Phạm Thị Ngọc Lan, Huỳnh Ngọc Thành (2012), “Nghiên cứu nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ ao nuôi tôm ở đầm Sam - Chuồn, Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 63, số 4. Trang 157 - 165. 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC TẬP 3, SỐ 2 (2013) [5] Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Huế. 17