Nội dung

MỤC LỤC MỞ ĐẦU.......................................................................................................4 1.Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................4 2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................5 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài..................................................5 Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................6 1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm và giá trị của cây cà chua...................6 1.1.1. Nguồn gốc...........................................................................................6 1.1.2. Phân loại thực vật..............................................................................6 1.1.3. Đặc tính thực vật..............................................................................78 1.1.4. Gía trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế...............................................10 1.2. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam......................12 1.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới...........................................12 1.2.2. Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam............................................14 1.3. Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng......................................................................................................15 1.3.1. Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng.............15 1.3.2. Cơ sở di truyền của đột biến................................................................17 1.3.3. Các tác nhân gây đột biến...................................................................18 1.4. Ứng dụng của phương pháp gây đột biến trong nghiên cứu chọn giống. .20 1 1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới...........................................................20 1.4.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam..........................................................23 1.5. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng.........25 1.5.1. Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng. .25 1.5.2 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cà chua........................................................................................................34 Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN.......36 2.1. Nội dung nghiên cứu............................................................................36 2.2. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................36 2.2.1. Vật liệu thực vật……………………………………………………36 2.2.2. Hoá chất............................................................................................36 2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................38 2.3.1. Phương pháp chiếu xạ gây đột biến..................................................38 2.3.2. Phương pháp đánh giá ngoài đồng ruộng........................................38 2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN tổng số...............................................40 2.3.4. Phương pháp PCR...............................................................................41 2.3.5. Điện di sản phẩm PCR......................................................................41 2.3.6. Phương pháp nhuộm Ethidium Bromide với gel polyacrylamide.....42 2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu..........................................................42 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................45 2 3.1. Xác định liều chiếu xạ thích hợp đối với hạt cà chua..........................45 3.2. Đặc điểm nông sinh học và khả năng sinh trưởng, phát triển của các giống cà chua thế hệ M1.............................................................................48 3.2.1. Đặc điểm nông sinh học....................................................................48 3.2.2. Khả năng sinh trưởng của các giống cà chua thế hệ M1..................51 3.3. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và chọn lọc những biến dị ở quần thể M2.................................................................................................54 3.3.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của quần thể M2............54 3.3.2. Chọn lọc các biến dị ở quần thể M2.................................................57 3.5.Đặc điểm sinh trưởng, năng suất và chất lượng của các dòng cà chua đột biến ở quần thể M3................................................................................61 3.5.1. Đánh giá về chiều cao cây ở thê hệ M3............................................62 3.5.2. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng chiếu xạ ở thế hệ M3..................................................................................................64 3.5.3. Đánh giá chất lượng quả của các dòng chiếu xạ ở thế hệ M3........68 3.6. Đánh giá đa dạng di truyền của các dòng cà chua đột biến ở thế hệ M3..................................................................................................70 KẾT LUẬN.................................................................................................80 3 MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill ) là một loại rau ăn quả có giá trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại rau ưu tiên có chiều hướng phát triển mạnh cả về chất và lượng. Chính vì vậy, sản lượng cà chua trên thế giới luôn tăng mạnh. Theo thống kê của FAO (2006) sản lượng cà chua đứng thứ hai trên thế giới sau khoai tây. Cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp thế giới, sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam đang trên đà phát triển dựa trên những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, đưa cây trồng có giá trị cao vào canh tác nhằm tăng thu nhập cho người dân, đặc biệt là loại cây trồng ngắn ngày nhanh cho thu hoạch phù hợp với phương thức sản xuất luân canh, có khả năng xuất khẩu và chế biến công nghiệp nên cây cà chua là đối tượng được quan tâm và đặt lên hàng đầu. Trong những năm qua, các cơ quan chuyên môn, nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu cây cà chua theo nhiều hướng khác nhau, một trong các hướng đã được các nước ứng dụng rộng rãi là phương pháp chọn giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ, một ứng dụng của kỹ thuật hạt nhân trong nông nghiệp để cải tạo, nâng cao chất lượng của các giống cây trồng đồng thời cũng phát triển các giống mới với đặc điểm sinh học được cải tiến. Bằng phương pháp chiếu xạ giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so với các phương pháp chọn giống truyền thống đồng thời có thể tạo ra những tính trạng quý chưa có ở giống gốc. Chọn giống đột biến đóng góp vai trò quan trọng trong việc cải tiến cây trồng nói chung và cà chua nói riêng. 4 Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ. Việc kết hợp sinh học phân tử và chọn giống đột biến đã chứng tỏ đó là phương pháp có hiệu quả. Kỹ thuật phân tử được sử dụng để lập bản đồ và sàng lọc những chỉ thị phân tử liên kết với những gen đột biến để xác định bản chất đột biến xảy ra trong khi chúng rất khó biểu hiện ra kiểu hình. Đồng thời, điều đó cũng nhằm xây dựng chiến lược trong việc sử dụng những gen đột biến trong cải tiến giống. Việc kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử với nghiên cứu gây tạo đột biến được thực hiện một cách chặt chẽ, có thể cung cấp những phương pháp nghiên cứu chính xác, hiệu quả, nhanh và kinh tế hơn trong công tác cải tiến cây trồng theo hướng chọn giống đột biến. Việc xác định các giống cà chua có năng suất cao đáp ứng nhu cầu con người và giúp tăng thu nhập cho người nông dân là vấn đề cấp thiết được đặt ra. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba”. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo ra các dòng cà chua đột biến có năng suất cao bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số dòng cà chua có triển vọng giúp tăng thu nhập cho người dân. - Đề tài bổ sung thêm vào các tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy và nghiên cứu. 5 Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm và giá trị của cây cà chua 1.1.1. Nguồn gốc Cà chua có nguồn gốc ở Pêru, Bolivia và Equado. Trước khi Crixtop Côlông phát hiện ra châu Mỹ thì ở Pêru và Mêhicô đã có trồng cà chua. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Pêru), Bolivia và Equado. Các nhà thực vật học De candolle (1884), Mulle (1940), Luckuwill (1943), Brezney (1955)… đều thống nhất cho rằng cây cà chua có nguồn gốc ở bán đảo Galapagos bên bờ biển Nam Mỹ, Pêru, Equado và Chilê. Người trồng trọt đã thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại, những giống và loài hoang dại được mang từ nơi xuất xứ đến Trung Mỹ , cuối cùng đến Mêhicô. [6] Theo các tài liệu của châu Âu thì chắc chắn cà chua được người Aztec và người Toltec mang đến. Đầu tiên người Tây Ban Nha đem cà chua từ châu Âu về, rồi sau đó đưa đến vùng Địa Trung Hải. Đầu thế kỷ 18, cà chua đã trở lên phong phú, đa dạng nhiều vùng trồng làm thực phẩm. Thời kỳ này cà chua lại từ châu Âu quay lại Bắc Mỹ. Cho đến thế kỷ 19, cà chua trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn thường nhật và được trồng rộng rãi. 1.1.2. Phân loại thực vật Cà chua thuộc họ Solanaceae, chi Lycopersicon. Tên khoa học là Lycopersicon esculencum Mill. Theo tác giả Breznhev.D (1964) Lycopersicon gồm 3 loài thuộc hai chi phụ Subgenus 1- Eulycopersicon: các dạng cây một năm, quả không có lông, màu đỏ hoặc vàng, hạt mỏng, rộng…..chi này gồm một loài L. Esculentum Loài này chia làm 3 loài phụ. 6 + ssp. Spontaneum Brezh: (cà chua dại): có hai biến chủng là var. Racemigerum và var.Pimpinellifolium: hai biến chủng này thường quả nhỏ, hàm lượng chất khô cao, chống bệnh tốt và có giá trị để sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho chọn giống. + ssp. Subspontaneaum ( cà chua bán trồng): có 5 biến chủng là: Var. Pruniform: Dạng quả mận Var. purifomae: dạng quả lê Var. cerasifomae: dạng quả anh đào Var. Elongatum: dạng quả dài hay gọi là dạng quả nhót. Var. Succenturiatum: dạng quả nhiều ngăn hạt. Năm biến chủng này thân mập, quả rất nhỏ, dùng làm vật liệu chọn giống. + ssp. Cultum (cà chua trồng): gồm 3 biến chủng Var. Vulgare: cà chua thường Var. Validum: dạng thân bụi. Var. Grandiflium: dạng kiểu lá khoai tây. Subgenus 2- Eriopersicon: chi phụ này gồm các loài dại, cây dạng một năm hoặc nhiều năm, gồm các dạng quả có lông, màu trắng, xanh lá cây hay vàng nhạt, có các vệt màu antoxian hay xanh thẫm. Hạt dày không có lông màu nâu…chi phụ này gồm hai loài và các loài phụ. + Loài L. Peruvianum. Mill: loài này có nhiều biến dạng trong đó có. Var. Cheesmanii Riloey; var. Chessmaniifminor.C.H.Mull; var.Dentatum Dum. + Loài L. Hirsutum Humb.et.Bonpl: loài này gồm hai loài phụ Var. glabratum C.H. Mull và var. glandulosum C.H.Mull. có một vài tính trạng có ý nghĩa trong chọn giống, các cơ quan sinh trưởng phủ một lớp lông tơ. 7 1.1.3. Đặc tính thực vật Cà chua là cây một năm. Tuy nhiên trong điều kiện tối ưu nhất định cà chua có thể là cây nhiều năm. 1.1.3.1. Hệ rễ Cà chua có hệ rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn. Trong điều kiện tối ưu những giống tăng trưởng mạnh có hệ rễ ăn sâu 1- 1,5m và rộng 1,5-2,5m. Vì vậy cà chua chịu hạn rất tốt. Khi cây rễ chính bị đứt, bộ rễ phụ phát triển và phân bố rộng nên cây cũng chịu đựng được điều kiện khô hạn.Trong quá trình sinh trưởng, hệ rễ chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện môi trường như nhiệt độ đất, độ ẩm…ở nhiệt độ đất thấp (14-160C) sự phát triển rễ chậm lại 15-20 ngày. Nhiệt độ đất cao (>350C) rễ cà chua phát triển bị trở ngại và có thể bị chết. 1.1.3.2. Thân Thân tròn thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hoá gỗ. Thân mang lá và phát hoa. Ở nách lá là chồi nách, chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng sinh trưởng mạnh và phát dục lớn so với các chồi nách gần gốc. Tuỳ khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm 4 dạng hình: Dạng sinh trưởng hữu hạn: chiều cao từ 65-120cm Dạng sinh trưởng vô hạn: Chiều cao cây từ 120->200cm, thân sinh trưởng mạnh Dạng sinh trưởng bán hữu hạn: Chiều cao cây 65-95cm Dạng lùn: cây thấp, chiều cao cây dưới 65cm, cây lùn mập, khoảng cách giữa các lóng ngắn. 8 1.1.3.3. Lá Lá cà chua là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác. Lá thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, ngọn lá có một lá riêng gọi là lá đỉnh. Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tuỳ giống, phiến lá thường phủ lông tơ. Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên. Số lá là đặc điểm di truyền của giống, nhưng cũng bị ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình hình thành. Khi hình thành 10 lá đầu tiên cần nhiệt độ trung bình hơn 130C, hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm là 240C, nếu nhiệt độ thấp hơn 130C thì quá trình xuất hiện lá mới sẽ chậm lại. 1.1.3.4. Hoa Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính. Sự thụ phấn chéo ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được. Số lượng hoa trên chùm hoa thay đổi tuỳ giống và thời tiết, thường từ 5-20 hoa. Màu sắc của cánh hoa thay đổi theo quá trình phát triển từ vàng xanh đến vàng tươi rồi vàng úa. Hoa cà chua nhỏ, hoa đính vào chùm bằng một cuống ngắn. Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuống hoa, khi gặp điều kiện không thuận lợi sẽ thúc đẩy quá trình hình thành tầng rời, lớp tế bào sẽ khô héo và chết. Cà chua có 3 loại chùm hoa: Đơn giản, trung gian và phức tạp. Cà chua là loại cây có khả năng ra hoa nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp, đặc biệt khi gieo trồng trong những điều kiện bất lợi. Nguyên nhân rụng nụ, hoa rất phức tạp song chủ yếu do hình thành tầng rời, lớp tế bào bị chết làm cho hoa rụng khỏi chùm. Số hoa trên cây là đặc điểm di truyền của giống 9 nhưng cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng dinh dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc….. 1.1.3.5. Qủa Qủa thuộc loại mọng nước gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn và giá noãn. Qủa cà chua được cấu tạo từ 2 đến nhiều ngăn. Số lượng quả trên cây là đặc tính di truyền của giống và cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng dinh dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc… Số lượng quả thay đổi lớn từ 4-5 quả đến vài chục quả. Khối lượng quả có sự chênh lệch đáng kể giữa loài và trong loài từ 2-3g đến 200-300g. Trên cùng một giống cà chua, số lượng quả và khối lượng quả có sự tương quan nghịch: số lượng quả nhiều thì khối lượng quả nhỏ và ngược lại. Số lượng quả trên cây cũng tương quan rất chặt đến năng suất. Đây cũng là một trong những tính trạng quan tâm của các nhà chọn tạo giống. Hình dạng quả cà chua thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài. Vỏ quả có thể nhẵn hoặc có khía. Màu sắc của quả thay đổi tuỳ giống và điều kiện thời tiết, thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu vỏ quả và thịt quả. Chất lượng quả cà chua được thể hiện qua các chỉ tiêu: cấu trúc quả, độ rắn, tỉ lệ thịt/quả, tỉ lệ đường/ axit và sắc tố quả. Sự cân bằng về đường và axit thể hiện hương vị thích hợp. 1.1.3.6. Hạt Hạt cà chua nhỏ, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối. Hạt nằm trong buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm của hạt. Trung bình có 50-350 hạt trong quả, trọng lượng 1000 hạt là 2,5-3g. 1.1.4. Gía trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế Cà chua là loại rau quả quý được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150 năm qua. Trong quả chín có nhiều chất dinh dưỡng như đường, vitaminA, vitamin C và các chất khoáng quan trọng như Ca, Fe, P, K, Mg…[6] 10 Theo ED War, D.C Tigche LAAR (1989) thành phần hoá học trong quả cà chua chín như sau: - Nước: 94 – 95% - Chất khô: 5 – 6% trong đó: 55% đường; 21% chất khô hoà tan trong rượu, protein, xenlulozơ, pectin, polysaccarit; 7% chất vô cơ; 5% các chất khác. Theo PGS.TS. Hồ Hữu An (2003-2006) cho thấy thành phần dinh dưỡng trong quả cà chua phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thời vụ gieo trồng, giống và các biện pháp kĩ thuật gieo trồng. Cà chua còn được sử dụng về mặt thẩm mỹ và y học: Cà chua có thể dùng để chống tiêu chảy, chữa bỏng nắng, giảm đau, làm lành vết thương. Cà chua còn làm thuốc tăng lực, bổ gan và chống xơ gan, sử dụng cà chua hàng ngày giúp chúng ta tiêu hoá khi ăn nhiều mỡ động vật, trứng, phomat…phòng được bệnh xơ cứng thành mạch. Phụ nữ dùng quả cà chua đắp mặt hàng ngày làm cho da căng sáng, không nếp nhăn, chống lão hoá.Trong cà chua còn chứa các amino axit (trừ triptophan), giá trị dinh dưỡng của cà chua rất phong phú vì vậy hàng ngày mỗi người sử dụng từ 100 – 200g cà chua sẽ thoả mãn nhu cầu vitamin cần thiết và các chất khoáng chủ yếu. Lycopen có trong cà chua là chất chống oxi hoá tự nhiên liên quan tới vitamin A đã được chứng minh có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư tuyến tiền liệt, vì lycopen là chất có khả năng ngăn ngừa các gốc tự do gây ung thư. Cà chua còn dùng để làm tăng hương vị của các món ăn và tạo cho món ăn thêm hấp dẫn, cà chua có thể chế biến thành nhiều loại khác nhau như cà chua cô đặc, nước cà chua, cà chua nguyên quả đóng hộp, cà chua muối, dầm dấm, làm salat, mứt…[7] 11 Cà chua không chỉ là cây rau có giá trị kinh tế cao, nó còn là mặt hàng xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới. Tuỳ theo đặc điểm của từng vùng sinh thái, tuỳ mùa vụ, một sào bắc bộ có thể cho thu nhập từ 1-3 triệu đồng. Theo trung tâm khuyến nông quốc gia (31/03/2006) cà chua trái vụ ở Thực Đạt (Hải Dương) thu được 3-5 triệu/sào (80 triệu đồng/ha). Có thể nói cà chua đã trở thành cây xoá đói, giảm nghèo cho người dân nơi đây. 1.2. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới Cà chua đã trở thành một trong những cây trồng thông dụng và được trồng phổ biến, rộng rãi trên khắp thế giới. Nghiên cứu lịch sử trồng trọt cho biết đến tận thế kỉ thứ 19, cà chua vẫn chỉ được trồng như một cây cảnh nhờ màu sắc đẹp của quả. Ngày nay, người ta đã biết ankaloid trong quả cà chua là tomatin, một chất ít độc kể cả khi nó có hàm lượng rất cao. Bởi vậy, sản xuất và sử dụng cà chua trên thế giới không ngừng tăng lên. Từ năm 1990 – 2001 diện tích trồng cà chua trên thế giới từ 2.868,443 ha tăng lên 3.745,299 ha và sản lượng từ 76.022,112 tấn tăng lên 100.259,346 tấn nhưng năng suất gần như không tăng. Phải chăng do những ứng dụng tiến bộ kỹ thuật mới vào trồng trọt, chăm sóc cà chua chưa nhiều. Trong những năm gần đây diện tích, năng suất và sản lượng cà chua tăng lên thể hiện qua bảng sau 12 Bảng 2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới Năm Diện tích Năng suất Sản lượng (nghìn ha) (tấn/ha) (nghìn tấn) 2000 3.750,176 27.192 101.975,637 2001 3.745,229 26.770 100.259,346 2002 3.998,219 27.005 107.972,098 2003 4.188,389 27.921 116.943,619 2005 4.570,869 27.222 124426,995 Nguồn:theo thông kê của FAO (2000-2006) Thống kê của FAO cho thấy, diện tích cà chua trên thế giới năm 2005 đạt 4.570,869 ha tăng gấp 1,4 lần so với năm 1995. Bảng 2.2: Sản lượng cà chua của thế giới và các nước dẫn đầu TT Quốc gia 1 Thế giới 2 1995 2000 2003 2005 87.592,093 108.339,598 116.943,619 124.426,995 Trung Quốc 13.172,494 22.324,767 28.842,743 31.644,040 3 Mỹ 11.784,000 11.558,800 10.522,000 11.043,300 4 Thổ Nhĩ Kỳ 7.250,000 8.890,000 9.820,000 9.700,000 5 Ấn Độ 5.260,000 7.430,000 7.600,000 7.600,000 6 Italy 5.182,000 7.538,100 6.651,505 7.087,016 7 Ai Cập 5.034,179 6.785,640 7.140,198 7.600,000 8 Tây Ban Nha 2.841,100 3.766,328 3.947,327 4.651,000 9 Braxin 2.715,016 2.982,840 3.708,600 3.396,767 10 Iran 2.403,367 3.190,999 4.200,000 4.200,000 11 Mêhico 2.309,968 2.086,030 2.148,130 2.800,115 13 12 Hy Lạp 2.064,160 2.085,000 1.830,000 1.713,580 Nguồn:Thống kê của FAO (200-2006) Qua bảng tổng kết cho thấy: Đến năm 2005 thì Trung Quốc vẫn luôn là nước đứng đầu trên thế giới về diện tích và sản lượng cà chua, tiếp theo là Mỹ và Thổ Nhĩ Kỳ. Có thể thấy rằng cà chua đang là mặt hàng nông sản được sản xuất chủ lực ở các nước ôn đới và á nhiệt đới. 1.2.2. Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam Ở nước ta, cà chua được trồng trên 100 năm nay, diện tích trồng cà chua hàng năm biến động 12.000 -13.000 ha. Theo thống kê sơ bộ năm 2005 thì diện tích trồng cà chua cả nước là 23.354 ha tăng 3,34 lần so với năm 2000 (6967 ha), với năng suất trung bình đạt 198 tạ/ha. Sản lượng đạt 462,435 tấn. Năng suất cà chua ở nước ta nói chung còn thấp, chỉ khoảng 60-65% so với năng suất bình quân của thế giới. Các vùng trồng cà chua lớn nhất ở nước ta là : Hải Dương, Nam Định, Bắc Giang, Lâm Đồng… đây là những vùng trồng cà chua đạt năng suất cao nhất cả nước ( năng suất ≥ 200 tạ/ha). Bảng 2.3. Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua giai đoạn 2000-2005 Năm Diện tích Năng Suất Sản lượng (1000 ha) (tạ/ha) (1000 tấn) 2000 6,967 196,3 136,734 2001 11,492 156,4 179,755 14 2002 18,868 165,5 312,178 2003 21,628 164,1 354,846 2004 24,644 172,1 424,126 2005 23,354 198,0 462,435 Nguồn: Trích số liệu của tổng cục thống kê 2006 Ở nước ta, cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất vào vụ đông, mặc dù trong những năm gần đây có nhiều cố gắng trong công tác chọn giống và công nghệ nhưng vụ đông vẫn là vụ chính cho sản lượng và chất lượng cao nhất. Trong cả nước có khoảng 22 giống cà chua chủ lực trong đó có 10 giống được sử dụng nhiều nhất với tổng diện tích 6253 ha tương đương với 55% diện tích cả nước đứng đầu là giống M383 sau đó đến giống VL200, Tn002, Cà chua Mỹ, cà chua balan, Red crow, T42, VI2910 và giống Trang Nông. 1.3. Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng 1.3.1. Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của thực vật vì lợi ích của loài người [32]. Để tạo ra nguồn biến dị mới với các tính trạng mong muốn các nhà chọn tạo giống phải áp dụng nhiều biện pháp khác nhau như chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa bội thể và gần đây nhất là áp dụng công nghệ sinh học trong chọn giống. Chọn lọc là phương pháp cơ bản của chọn giống. Tuy nhiên, phương pháp chọn lọc chỉ đưa lại kết quả khi quần thể ban đầu đa dạng về kiểu gen. Kết quả của các phương pháp chọn lọc chỉ là thừa hưởng những kho 15 tàng biến dị có sẵn trong tự nhiên chứ không phải là tạo ra được những biến dị mới. Bằng các biện pháp lai tạo và gây đa bội thể thực nghiệm người ta đã làm phong phú thêm nguồn biến dị trong tự nhiên. Một hiệu ứng đặc biệt nhận được trong lai giống là ưu thế lai biểu hiện ở thế hệ F1. Tuy nhiên ở cây trồng do đặc điểm cấu trúc hoa và hệ thống sinh sản của chúng gây cản trở cho việc áp dụng tạo giống ưu thế lai (bất hợp lai, F1 không có khả năng sống, F1 bất dục, sự suy nhược của con lai). Bằng các phương pháp này ta cũng chỉ mới sử dụng một số ít gen trong hệ thống gen của một cơ thể thực vật quá trình chọn lọc và lai tạo cũng phải trải qua một khoảng thời gian khá dài. Đột biến là cơ sở của tiến hoá hình thành nên các giống cây trồng, vật nuôi mới. Đột biến là một con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng sự biến dị trong cơ thể sinh vật, nó là sự biến đổi bất thường về vật chất di truyền dẫn đến sự biến đổi một hoặc nhiều tính trạng và có thể được di truyền cho thế hệ sau. Đột biến gồm hai loại đột biến tự phát và đột biến nhân tạo. Đột biến tự phát là dạng đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong tự nhiên do những biến đổi thời tiết, khí hậu do những thay đổi về yếu tố địa lý v.v… Trong tự nhiên những biến đổi đột ngột do những biến động thời tiết khí hậu, địa lý làm cho sinh vật mới thích nghi hơn với điều kiện sống qua quá trình tiến hoá hàng trăm, thậm trí hàng nghìn năm những giống cây trồng, vật nuôi mới này hình thành những đặc tính khác biệt so với giống cũ. Đột biến tự phát xảy ra trong tự nhiện có tần số rất thấp thường 10-9 nghĩa là khoảng 10 triệu cá 16 thể mới xuất hiện một cá thể bị đột biến và không phải đột biến nào cũng có ý nghĩa cho con người. Đột biến nhân tạo: là đột biến xảy ra do các tác nhân (vật lý hoặc hoá học) gây đột biến được thực hiện bởi con người vì mục đích chọn giống. Nhờ việc sử dụng của các tác nhân gây đột biến người ta có thể tạo được các giống mới trong một khoảng thời gian ngắn và trong một phạm vi thí nghiệm hẹp. Gây đột biến là một phương pháp để bổ sung nguồn gen trong chọn giống cây trồng. Sau những năm 1995, cùng với sự bùng nổ thông tin của công nghệ thông tin đã có sự tăng cường trao đổi thông tin giữa các nhà khoa học về việc không chỉ gây đột biến để cải tiến giống cây trồng mà còn ứng dụng gây đột biến để khám phá gen kiểm soát những tính trạng quan trọng và tăng sự hiểu biết chức năng và cơ chế hoạt động của chúng, mà còn giải mã bản chất sinh học của những biến đổi trong chuỗi ADN, sự tự sửa chữa các đột biến. Những nghiên cứu về đột biến đã có những thay đổi về lượng và cả về chất, nghiên cứu tìm hiểu tận gốc những thay đổi trong chuỗi ADN do những tác nhân đột biến gây nên. Thậm trí người ta có thể nghĩ đến gây bất hoạt gen nhờ đột biến nhằm ức chế hoặc tạo ra một loại sản phẩm protein mới dẫn đến thay đổi chất lượng của cây trồng. 1.3.2. Cơ sở di truyền của đột biến Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ lúc nào và ở bất kỳ tế bào nào. Các tác động lên kiểu hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp phân tích phân tử đến những biến đổi lớn 17 dẫn đến thay đổi những quá trình cơ bản của tế bào dẫn đến có thể làm chết tế bào hoặc cả cơ thể. Đột biến có thể phân chia theo nhiều cách khác nhau. Ở các sinh vật đa bào, sự phân biệt quan trọng dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến. Những đột biến xuất hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen nhân (germ- line mutations). Những đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma có thể tạo ra một sinh vật vừa có các mô tế bào đột biến vừa có các mô bình thường. Hiện tượng này còn được gọi là đột biến khảm. Đột biến tế bào sinh dưỡng có thể không được di truyền cho thế hệ sau. Đối với cây nhân giống vô tính thì tuỳ vào vị trí và phần trăm của mô sinh dưỡng người ta có thể phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau. Ở các loài thực vật bậc cao các đột biến soma có thể được nhân giống vô tính do đó vẫn có thể giữ lại được các đột biến này [34]. Dựa vào sự thay đổi cấu trúc di truyền đột biến được phân thành hai loại đó là đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Đột biến nhiễm sắc thể (NST) là sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể. Đột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ở toàn bộ các cặp NST. Loại đột biến này phát sinh có thể là do các tác nhân của ngoại cảnh (do chất phóng xạ, hoá chất, sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loạn của quá trình trao đổi chất của nội bào dẫn đến sự phân ly không bình thường của các cặp NST. Trường hợp NST trong tế bào sinh dưỡng tăng lên thành bội số của n (nhiều hơn 2n) được gọi chung là thể đa bội. Tế bào đa bội có lượng ADN tăng gấp bội, quá trình tổng hợp các chất hữu cơ diễn ra mạnh mẽ do đó kích thước tế bào lớn hơn. Cơ 18 thể đa bội thường có cơ quan sinh dưỡng to, phát triển khoẻ, chống chịu tốt. Hiện tượng đa bội khá phổ biến ở thực vật và đã được ứng dụng hiệu quả trong chọn giống cây trồng. Đột biến NST có các dạng mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn. Đột biến gen là những biến đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử ADN. Sự biến đổi về cấu trúc phân tử của gen có thể dẫn tới biến đổi cấu trúc của một loại protein do gen đó mã hoá và cuối cùng dẫn đến biến đổi ở kiểu hình. Ngoài những đột biến gen xảy ra trên ADN của NST còn xảy ra đột biến ADN của các bào quan như ty thể, lạp thể có thể gây ra những biến dị di truyền theo dòng mẹ. 1.3.3. Các tác nhân gây đột biến Bằng chứng về các tác nhân ngoại cảnh có thể làm tăng tỉ lệ đột biến được công bố vào năm 1927 bởi Hermann Muller, ông đã chứng minh tia X là tác nhân gây đột biến ở ruồi giấm. Kể từ đó một số lượng lớn các tác nhân gây đột biến được khám phá và được phân thành hai loại đó là tác nhân vật lý và tác nhân hoá học [35]. Ngay từ những năm 1940 Auerbach và Robson dã khẳng định một số hoá chất có khả năng gây đột biến. Trước những năm 60 của thế kỉ XX trên thế giới người ta mới sử dụng các tác nhân gây đột biến hoá học. Ngày nay có đến hàng chục nhóm chất hoá học hoặc hàng ngàn dẫn xuất của chúng có khả năng gây đột biến nhưng nếu xét về phương thức tác dụng chúng có thể được chia thành năm nhóm như sau: - Các chất kìm hãm sự tổng hợp của các bazơ nitơ, tham gia vào thành phần axit nucleic dẫn đến việc hình thành các gốc không bình thường gây 19 ra sự đột biến. Các chất này gồm có: coephin, ethyluretan, theobromin… - Các chất đồng đẳng của bazơ nitơ như 5- bromuracil (đồng đẳng của thymin), 2-aminopurin (đồng đẳng của adenin) tham gia vào thành phần DNA cũng có thể gây đột biến. -Các hợp chất alkyl hoá như EI (ethyleneimin), EMS (ethylmethanesulfonate). Các hợp chất này có khả năng alkyl hoá các nhóm phosphate trong phân tử ADN cũng như các bazơ purin hay pyrimidine dẫn đến sự đột biến. - Các chất ôxi hoá khử và các gốc tự do như peroxyt, HNO2, aldehyt… gây đột biến liên quan đến sự dezamin hoá các gốc purin và pyrimidine của ADN và ARN. - Các chất nhuộm màu thuộc nhóm acridin, các chất này khi phản ứng với ADN thì tạo thành một phức hệ làm rối loạn sự tái sinh bình thường của ADN. Tác nhân gây đột biến vật lý là những dạng tia phóng xạ. Muller và Xapeghin là những người đầu tiên đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng. Sau đó phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là các nhà di truyền chọn giống của Liên Xô, Đức, Nhật, Thuỵ Điển…Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn gống lựa chọn. Bên cạnh tia cực tím một số các tia phóng xạ ion hoá như tia X, tia gamma, hạt alpha, beta, hạt proton, neutron, ion beam có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào. Những tổn thương sinh học do phóng xạ gây ra được hình thành qua hai con đường: - Phóng xạ tác động trực tiếp xảy ra ở phân tử ADN và gây ra đột biến 20 gen. - Phóng xạ tác động gián tiếp, nó được các các phân tử khác trong tế bào hấp thụ, sau đó các năng lượng này hoặc các sản phẩm của nó được truyền vào ADN dẫn đến biến đổi về cấu trúc ADN. Tia phóng xạ có tác dụng khác nhau đến thực vật tuỳ thuộc vào kiểu phóng xạ, liều lượng phóng xạ, đặc tính di truyền của giống, trạng thái sinh lý sinh hoá của bộ phận được xử lý và một yếu tố của môi trường bên ngoài [35]. 1.4. Ứng dụng của phương pháp gây đột biến trong nghiên cứu chọn giống 1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới Vào năm 1964 ở Roma, một hội nghị do FAO và IAEA tổ chức đã đưa ra những đánh giá về kết quả và triển vọng của phương pháp chọn giống đột biến đối với cải tiến giống cây trồng và 5 năm sau người ta công bố đã có 77 giống đột biến ra đời. Những năm 1970, Cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) và Tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu gây đột biến cải tạo cây nông nghiệp và cây công nghiệp nhiều nước trên thế giới nhằm tạo ra hàng loạt giống mới như: lúa, lúa mỳ, lúa mạch, táo, chanh, mía, chuối... Năm 1990, hội nghị do FAO/IAEA tổ chức thông báo có 1363 giống cây trồng được tạo ra từ phương pháp đột biến ở 48 quốc gia, trong đó có 559 giống hoà thảo và 415 giống cây trồng. Đến năm 1996 cũng theo FAO/ IAEA công bố đã có tới gần 1800 giống cây trồng. Cho tới năm 2003 (FAO/IAEA Mutant Varieties Database), 2317 giống cây trồng đã được tạo ra bằng gây đột biến thực nghiệm trên phạm vi 60 nước, trong số đó có 1585 giống cây trồng được trực tiếp sử dụng sau khi 21 gây đột biến và 667 giống được sử dụng một cách gián tiếp như là vật liệu trong các phép lai. Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến cây trồng đã mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về mặt kinh tế, ước tính các nước đã thu được hàng tỷ đô la từ hàng triệu hecta gieo trồng những giống cây được tạo ra từ đột biến.[33] Hiện nay theo thống kê mới nhất của FAO/IAEA đã có trên 3000 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp đột biến, trong đó riêng lúa có hơn 600 giống và Trung Quốc là nước dẫn đầu thế giới về trồng lúa đột biến có những tính trạng đặc sắc. Hơn 90% các giống đột biến nói trên đựơc tạo ra nhờ việc sử dụng tia x và tia Gamma. Phần lớn các giống được đưa vào sản xuất là những dạng có thay đổi về kiểu hình thời gian ra hoa, màu và dạng hoa, kích thước và màu quả, chống sâu bệnh. Một số đột biến có giá trị khác như: thay đổi hàm lượng Protein, axit amin, chất lượng tinh bột ở nội nhũ hạt… Năn 1967, Swaminathan (Ấn Độ) đã dùng tia gamma và tia tử ngoại chiếu lên hạt giống lúa mỳ Mehico Suorra 64 đã tạo ra giống đột biến Sảbati có hàm lượng protein cao hơn giống gốc 2,3%. Ở viện nghiên cứu Crasnoda của Nga năm 1976 đã xử lý tia Laze lên hạt lúa mỳ tạo được giống đột biến Ljubov có hàm lượng protein tăng và năng suất tăng 15% so với giống gốc. Kutefa ( Trung Quốc) năm 1989 xử lý tia Rơnghen liều 9,3 Krad lên hạt nảy mầm giống lúa Wuxian 20 và chọn tạo được giống mới tăng năng suất so với giống gốc 30%. Cũng xử lý lên hạt nảy mầm giống Lungjing ở 2 liều 1 Kr và 2Kr tác giả thu được dạng đột biến thấp cây hơn giống gốc 30cm và năng suất vượt giống gốc 2,3 tấn/ha. 22 Năm 1965, Tedoradze XG đã sử dụng tia gamma liều 17Kr xử lý hạt đậu tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu được giống đậu tương chín sớm, chống chịu bệnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha. Ở Ấn Độ tác giả Kerketta V., Haque M.F bằng xử lý phóng xạ lên hạt giống đậu tương Birsa1 có vỏ hạt màu đen đã thu được những dòng đột biến có vỏ màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống gốc. [36] Tạo được giống đậu chống bệnh cũng là một thành công của phương pháp chiếu xạ. Tác gỉa Laseejan S. xử lý tia gamma liều 15 – 30 Kr lên hạt 11 giống và chọn lọc qua nhiều thế hệ thu được 16 dòng cho sản lượng hạt cao và chống bệnh gỉ sắt. Sonnino A, khi xử lý phóng xạ lên chồi cây khoai tây đã thu nhận được các đột biến cây lùn, thay đổi màu sắc vỏ củ. Trên đối tượng hoa cây cảnh cũng thu được nhiều thành công từ chọn giống chiếu xạ. Trong những năm từ 1987 – 1989, các nhà chọn giống Ấn Độ đã tạo được 37 dạng đột biến ở hoa cúc, 14 dạng đột biến ở hoa hồng khác nhau về kích thước, màu sắc hoa. Năm 2000, các tác giả của Thái Lan đã tiến hành chiếu xạ cụm chồi hoa cúc bằng tia gamma ở các liều chiếu là 10, 30, 50, 70, 90,110 Gy. Kết quả thu được cho thấy liều chiếu xạ 10Gy cho tỉ lệ sống cao nhất. Sau chiếu xạ đã tạo ra các cây cúc cho hoa có màu sắc kích thước và số lượng cánh hoa khác nhau trên cùng một bông hoa. Tác giả Xiao-Shan Shen, Jue-Zhen Wan, Wei- YiLuo và CS (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến chồi đồng tiền trong các môi trường nuôi cấy M1,M2,M3 ( là các môi trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi, môi trường tạo rễ) trong in vitro. Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều 23 chiếu xạ gây chết callus đồng tiền là từ 8 – 9Kr và liều có hiệu quả đột biến là 5 – 6Kr. 1.4.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã được cố giáo sư Lương Đình Của khởi xướng từ những năm 1960. Nhưng mãi đến năm 1980, hướng nghiên cứu này mới được phát triển một cách tương đối có hệ thống và định hướng do cố tiến sĩ Phan Phải và cộng sự tiến hành. Sau đó, một loạt nghiên cứu của các tác giả khác trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, hoa cúc... đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị, được chọn lọc và phát triển trực tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công tác lai tạo giống mới. Từ năm 1989 – 2000 Viện di truyền Nông nghiệp đã công bố 6 giống lúa quốc gia, trong đó giống DT10 được tạo ra nhờ xử lý tia gamma liều 20Kr lên hạt khô của giống C4-63. Cũng từ xử lý tia gamma liều 20Kr lên hạt khô của con lai F1 giữa giống TB1 và IR22, Viện kỹ thuật Nông nghiệp tỉnh Thái Bình đã chọn lọc được M174 có P1000 hạt là 40g .[15] Năm 1992, Phạm Văn Ro bằng phương pháp phóng xạ đối với một số giống lúa như Tài nguyên đục, Tép hành đã chọn tạo được các giống có thời giam sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với giống gốc. Năm 1994, Nguyễn Minh Công và Đào Xuân Tân tạo được 2 dòng đột biến từ nếp Quýt Bắc Ninh có hàm lượng protein cao hơn hẳn giống gốc bằng xử lý tia gamma lên hạt nảy mầm.[18] Nghiên cứu mới đây của Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản” Hiệu ứng chiếu xạ tia gamma ( nguồn Co 60) lên hạt lúa và những biến đổi di truyền trong M1 và M2” đã rút ra kết luận: Xử lý chiếu xạ tia gamma lên hạt lúa ướt ( ngâm sau 20h) với 3 liều lượng 15K, 20K, 25K đã tạo ra hiệu 24 ứng đột biến cao. Từ đó tạo nguồn vật liệu khởi đầu rất đa dạng và phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa. [10] Chiếu xạ tia gamma liều 18Kr lên hạt giống đậu tương AK-04 có hạt màu xanh, tác giả Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài và CS đã chọn được dòng DT95 có khả năng sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao, có trường hợp tới 200% so với giống đối chứng.[9] Trên cây lạc, tác giả Lê Song Dự khi chiếu liều 5Kr lên giống Bạch sa đã tạo ra giống mới B5000 có năng suất cao hơn giống gốc 20 – 30%, hàm lượng protein đạt 21,48%, dầu 52,5%. [11] Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro. Năm 2005, Đào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện Di Truyền Nông nghiệp đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều 1, 3, 5, 7 và 15Kr nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu. Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là 5Kr và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa có chóp cánh màu xanh.[40] Năm 2007, Viện Di Truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12Kr và liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỉ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 16Kr 1.5. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 1.5.1. Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng Chỉ thị phân tử được coi là những đoạn ADN đã được tìm thấy ở các vùng đặc hiệu trên bộ gen và được di truyền theo các quy luật từ thế hệ này sang thế hệ khác. Sự phát triển và sử dụng các loại chỉ thị phân tử 25 để phát hiện và khám phá sự đa hình của ADN, lập bản đồ di truyền và nghiên cứu sự liên kết của các tính trạng là một trong những tiến bộ nhất trong lĩnh vực di truyền phân tử. Sự hiện diện của rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau và sự khác nhau về nguyên lý, phương pháp và sự ứng dụng của chúng đòi hỏi sự cân nhắc trong việc lựa chọn một hoặc nhiều phương pháp. Chưa có một loại chỉ thị phân tử nào đáp ứng được tất cả các nhu cầu của các nhà nghiên cứu. Tuỳ theo các dạng nghiên cứu sẽ được đảm nhận có thể chọn một trong số các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau, mỗi kỹ thuật đó kết hợp ít nhất một vài đặc tính được mong đợi. Cho đến nay đã có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được phát triển và ứng dụng trong lĩnh vực chọn giống cây trồng ở mức độ phân tử người ta gọi là chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assisted SelectionMAS). Các loại chỉ thị này được phân thành các nhóm khác nhau dựa trên: a) Phương thức di truyền (di truyền nhân từ bố mẹ, di truyền nhân từ mẹ, di truyền cơ quan từ mẹ, di truyền cơ quan từ bố và mẹ.) b) Phương thức hoạt động của gen (chỉ thị trội hay đồng trội) c) Phương pháp phân tích (chỉ thị lai hoá hay chỉ thị PCR) [26] Chỉ thị phân tử dựa trên sự lai hoá RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là chỉ thị phân tử dựa trên lai hoá được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này dựa trên sự nhận biết của các enzyme giới hạn ở các vị trí khác nhau giữa các đoạn ADN ở các sinh vật riêng biệt. Nguyên lý và phương pháp của chỉ thị RFLP như sau: 26 - Phân cắt ADN với một hoặc nhiều enzyme - Phân đoạn các đoạn cắt giới hạn bằng agarose gel - Chuyển các đoạn cắt riêng biệt từ agarose gel sang màng lọc bằng Southern blotting. - Phát hiện các băng cá biệt bằng sự lai hoá axít nucleic với các mẫu dò. - Ưu điểm chủ yếu của chỉ thị RFLP là có khả năng tái bản cao, ưu thế trội, có khả năng chuyển giao tốt giữa các phòng thí nghiệm, cung cấp các chỉ thị locus đặc hiệu mà cho phép nghiên cứu (bảo tồn các gen giữa các sinh vật có họ hàng), không đòi hỏi thông tin về trình tự, và tương đối dễ chấm điểm do kích thước khác nhau giữa các đoạn ADN. Tuy nhiên, phương pháp RFLP vẫn còn có một vài hạn chế như sau: - Đòi hỏi mẫu ADN đem phân tích phải có số lượng và chất lượng tốt - Nó phụ thuộc váo sự phát triển của thư viện các mẫu dò đặc hiệu đối với từng loài. - Kỹ thuật này rất khó tự động hóa. - Mức độ đa hình thấp và chỉ có một vài locus được nhận biết sau mỗi lần thử. - Tốn thời gian, thiết bị và đắt tiền - Yêu cầu phải có mẫu dò đánh dấu phóng xạ. Các chỉ thị dựa trên PCR PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử, nó là sự sao mã các đoạn ADN nhờ enzyme mà không cần đến cơ thể sống. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN 27 có thể nhân bản một số lượng lớn các gen cần thiết nhờ một thiết bị biến đổi nhiệt và enzyme ADN polymerase. Những ưu điểm chính của kỹ thuật PCR so với phương pháp phân tích dựa trên sự lai hoá đó là chỉ cần một lượng nhỏ ADN và có thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ, có khả năng khuếch đại trình tự ADN từ các mô đã được bảo quản, có thể ứng dụng cho nhiều loại chỉ thị di truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm và trong thời gian ngắn và đây là một phương pháp có thể áp dụng được ở tất cả các phòng thí nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm về chi phí. Ngày nay dựa trên kỹ thuật PCR nhiều loại chỉ thị phân tử đã được phát triển và cho kết quả rất triển vọng. Các loại chỉ thị phân tử khác nhau dựa trên PCR được chia thành hai dạng dựa vào các mồi sử dụng để khuếch đại như sau: - Chỉ thị phân tử mồi ngẫu nhiên hoặc bán ngẫu nhiên không phát triển trên các đoạn ADN không cần biết trước trình tự (như APPCR, RADP, DAF, AFLP, ISSR) - Chỉ thị phân tử có chủ đích được phát triển từ các trình tự ADN đã biết (như ETS, CAPS, SSR, SCAR, STS…) SSR (Simple Sequence Repeat, Microsatellites) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp có trong hệ gen của các loài sinh vật bậc cao (Litt and Luty, 1989; Jacob et al, 1991). Phản ứng PCR đối với chỉ thị SSR được thực hiện nhờ sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược và kéo dài mạch từ đầu 5’ đến 3’ của ADN mạch khuôn. Các đoạn sản phẩm PCR thường được phân tích bằng cách điện di trên băng polyacrylamide kết hợp với nhuộm AgNO3 hoặc Ethylrium bromua (EtBt). Gel agarose (thường 28 3%) với EtBr cũng được sử dụng khi sự khác biệt về kích thước của các allen giữa các mẫu lớn hơn 10 bp. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotid trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại: - Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. - Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotid khác. - Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locut SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locut tính trạng số lượng (QTL). Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR 29 Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền [35]. SSR là chỉ thị đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những chỉ thị này so với những chỉ thị khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer và Pemberton, 1994). SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng chỉ thị SSR. Khi các mồi SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những mồi SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần [24]. Các chỉ thị SSR ngày nay là chỉ thị được lựa chọn ở hầu hết các lĩnh vực di truyền phân tử vì chúng có độ đa hình cao thậm chí ở các dòng có quan hệ gần gũi, nó không đòi hỏi chất lượng và số lượng DNA cao, có thể trao đổi thông tin giữa các phòng thí nghiệm [23]. Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi quá đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. 30 RAPD (Random amplified polymorphic DNA) RADP hay còn gọi là đa hình khuếch đại ngẫu nhiên ADN là kỹ thuật sử dụng các đoạn mồi có trình tự nucleotide ngẫu nhiên để nhân bản các đoạn ADN mạch khuôn trong bộ gen mà không cần biết trước trình tự của nó [32]. Kỹ thuật RADP thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên có khoảng 10bp có nhiệt độ bắt cặp mồi thấp (thường từ 34-37oC). Ưu điểm của kỹ thuật này là không cần biết trình tự nucleotide của đoạn ADN khuôn, quy trình tiến hành tương đối nhanh, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm nhỏ, cần một lượng mẫu ADN nhỏ. Tuy nhiên, chỉ thị RADP có một số hạn chế đó là các phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ và chất lượng của ADN khuôn, nồng độ của MgCl2, tỉ lệ giữa mồi và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp, nguồn enzyme taq polymerase. Tuy nhiên những hạn chế này có thể được khắc phục bởi việc lựa chọn phương pháp tách chiết ADN thích hợp và tối ưu hoá các thông số đã nêu trên. Một hạn chế khác của chỉ thị RAPD đó là RADP có tính trội do đó những gen nào điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong quá trình điện di. Chỉ thị DAF (DNA amplification fingeprinting) khác biệt với RAPD chủ yếu là sử dụng các mồi ngắn (ít nhất 5 bp), nồng độ mồi cao hơn, hai chu kỳ nhiệt thay cho ba chu kỳ nhiệt và nhận biết sản phẩm khuếch đại băng gel polyacrylamide nhuộm AgNO3. Đặc tính chủ yếu của AP- PCR khi so sánh với RAPD và DAF là: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Chỉ thị AFLP là sự kết hợp của RFLP với khả năng linh hoạt của kỹ thuật 31 PCR bằng cách gắn các mồi đã biết trình tự với các đoạn DNA được phân cắt bởi enzyme giới hạn [32 ] Ưu điểm của AFLP là: 1) Độ tin cậy cao và có khả năng tái bản 2) Không yêu cầu bất cứ thông tin về trình tự DNA của các sinh vật cần nghiên cứu 3) Cung cấp nhiều thông tin nhờ khả năng phân tích đồng thời một số lượng lớn các locus đa dạng (tỉ lệ đa phần hiệu quả) với sự kết hợp của các mồi riêng rẽ trên một bản gel riêng rẽ khi so sánh với RADPs, RFLP và microsatellites 4) Các sản phẩm khuếch đại AFLP cùng di chuyển hầu hết là tương đồng và ở locus đặc trưng ngoại trừ các loài đa bội So sánh với phương pháp RAPD hạn chế của AFLP là: a) Phương pháp này yêu cầu thực hiện nhiều bước để thu được kết quả. b) Phương pháp này yêu cầu các mẫu ADN sạch các thành phần ức chế có thể ảnh hưởng đến enzyme giới hạn. c) Kỹ thuật này yêu cầu sử dụng gel polyacrylamide kết hợp với nhuộm AgNO3, hoặc phương pháp đánh dấu phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang để xác định, nó sẽ đắt hơn và khó khăn hơn so với gel agarose. d) Phương pháp này đòi hỏi bổ sung chi phí để mua các emzyme giới hạn và các enzyme nối mạch cũng như các adapter. Giống như RAPD, phần lớn các locus AFLP là trội nó không phân biệt được sự đồng trội từ các thể dị hợp. Điều này làm giảm độ chính xác của chỉ thị AFLP trong phân tích di truyền quần thể, lập bản đồ di truyền 32 ISSR (inter- simple sequence repeat) ISSR là sự khuếch đại của các đoạn ADN tồn tại ở một khoảng có thể khuếch đại được giữa hai vùng lặp vi vệ tinh giống hệt nhau định hướng theo chiều đối diện. Kỹ thuật này sử dụng các vùng vi vệ tinh như các mồi trong một phản ứng PCR hướng tới nhiều locus của hệ gen để khuếch đại chủ yếu các đoạn lặp trình tự đơn giản của các đoạn có kích thước khác nhau. Ưu điểm của kỹ thuật này: Kỹ thuật này đơn giản, nhanh và không cần phải sử dụng các chất đánh dấu phóng xạ. Nhược điểm của ISSR là chỉ phân tích được các gen trội, không phát hiện được sự đa hình của gen lặn trong các cơ thể dị hợp và ISSR cũng không có khả năng phân tích các đoạn cùng dịch chuyển trên gel bắt nguồn từ các vùng không tương đồng [26]. EST (Expressed sequence tags) EST là chỉ thị phân tử bắt nguồn từ cDNA (complementary DNA) được tổng hợp của một phân tử mRNA. Mỗi cDNA là điển hình cho một gen được phân lập do đó các nhà khoa hoc có thể giải trình tự một vài trăm nucleotide từ đầu 5’ hoặc 3’ để tạo ra các đoạn đánh dấu trình tự biểu hiện 5’ (5’EST) hoặc 3’EST [25]. Việc tạo ra các chỉ thị EST được bắt đầu từ việc thiết lập các thư viện về cDNA. Chỉ thị EST đầu tiên được sử dụng để nhận dạng các bản sao của gen nhưng sau này nó là một công cụ để khám phá gen, thu thập số liệu về sự biểu hiện và điều hoà của gen và xác định trình tự gen để phát triển các trình tự có giá trị cao như RFLP, SSR, CAPS dựa trên chỉ thị EST. EST cũng đã được sử dụng để thiết kế 33 các mẫu dò cho ADN microarray. CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) CAPS là sự kết hợp của PCR và RFLP và đầu tiên nó được gọi là PCRRFLP [34]. Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật được xác định dựa vào kết quả so sánh kích thước các băng ADN của chúng, vì vậy mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN của các mẫu sinh vật có thể không khác nhau về kích thước nhưng lại có thể khác nhau về trình tự sắp xếp các nucleotide. Từ lý giải nói trên, các nhà khoa học đã sử dụng các enzym giới hạn để cắt sản phẩm RAPD, STS, SSR... nếu trình tự nucleotide của các sản phẩm đó chứa vị trí nhận biết của enzym nào đó thì nó sẽ bị cắt tại đó. Sự đa hình sẽ được phát hiện khi sản phẩm cắt được tiếp tục được điện di trong gel. SCAR (Sequence characterized amplified region) Chỉ thị SCAR là một đoạn ADN của hệ gen được xác định bằng sự khuếch đại bởi PCR sử dụng một cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu [32]. Các chỉ thị SCAR được thu nhận bằng cách nhân dòng và giải trình tự hai đầu mút của chỉ thị RAPD mà xuất hiện ở dạng đặc trưng cho các mục đích riêng biệt (ví dụ như băng RADP biểu hiện trong các dòng kháng bệnh nhưng không có ở trong các dòng dễ mắc bệnh). Chỉ thị SCAR có ưu điểm hơn chỉ thị RAPD vì chúng chỉ xác định một locus riêng biệt, sự khuếch đại của các chỉ thị này ít nhạy cảm với các điều kiện phản ứng và chúng có khả năng biến đổi trong các chỉ thị đồng trội . STS (sequence tagged site) Chỉ thị STS là một đoạn duy nhất, ngắn có trình tự xác định, mỗi chỉ thị STS được ghi nhận trên bản đồ tại một vị trí chuyên biệt nào đó trong 34 hệ gen. Ở thực vật các chỉ thị STS là một cặp mồi được thiết kế bằng cách giải trình tự một mẫu dò RFLP mà có số bản sao ít nhất khi phân tích [22] hoặc là các đoạn AFLP. Các mồi được thiết kế dựa trên chỉ thị RAPD đôi khi cũng được coi như chỉ thị STS. Chỉ thị STS là tiền đề cho phép chuyển đổi bản đồ di truyền thành bản dồ vật lý. Các chỉ thị STS là chỉ thị đồng trội, nó thích hợp với việc phân tích mẫu với số lượng nhiều và khả năng tự động hoá cao. SNP (single nucleotide polymorphism) Trong một số những công bố về trình tự hệ gen của một vài sinh vật đã có những nghiên cứu sự khác nhau về trình tự giữa các cá thể, giữa các giống hoặc dưới loài. Những nghiên cứu này đã khám phá ra sự đa hình của các nucleotide đơn (SNP) và cho thấy các gen bị thêm hoặc mất nucleotide rất nhiều và phân bố trong toàn bộ gen của các loài khác nhau kể cả thực vật. Đúng như tên của nó, một chỉ thị SNP là một base thay đổi trong một đoạn DNA với sự chuyển đổi thường xảy ra của hai nu bổ sung ở vị trí nhất định. Do đó SNP ngược lại với tất cả các phương pháp đã nói ở trên, việc xác định các allele không thể dựa trên sự khác biệt về kích thước khi điện di trên gel. Trong nhiều năm qua một số lượng lớn các phương pháp xác định kiểu gen SNP khác nhau và các hoá chất đã được phát triển dựa trên nhiều phương pháp khác nhau của việc đánh giá các allele và phát hiện các lý thuyết nền tảng. Tất cả các phương pháp của việc xác định kiểu gen SNP đều kết hợp hai yếu tố: đầu tiên là sự tạo ra của một sản phẩm của allele đặc hiệu và thứ hai là phân tích các sản phẩm đó. Ưu điểm của SNP đó là nó có tính ổn định rất cao về mặt di truyền, có thể ước đoán được tần suất allele dễ dàng trong bất cứ một 35 quần thể nào thông qua một loạt các kỹ thuật xét nghiệm. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là nó đòi hỏi chi phí rất cao. 1.5.2 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cà chua Việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cà chua đã có rất nhiều tác giả thực hiện, nhưng dùng chi thị SSR để đánh giá sự đa dạng của cà chua thì phải kể đến một số tác giả như: Kwo,YS, 2009 đã sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dang di truyền của cà chua. Tác giả sử dụng 33 mồi SSR được sàng lọc từ 63 giống cà chua có tổng số 132 mảng đa hình thu được hệ số PIC là 0,628 dị hợp là 0,21- 0,88 có 1302 locus hệ số tương đồng là 0,644. Solomon Benor, Mengyu Zhang, Zhoufe Wang, Hongsheng Zhang (2008) đã xác định tính đa dạng của 39 dòng cà chua chọn lọc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ. Sử dụng 35 mồi SSR thu được tổng cộng 150 alen, số lượng alen trung bình của mỗi locus là 4,3. Hệ số PIC là 0,31, hệ số tương đồng di truyền là 0.85, dòng được chia thành 4 nhóm. Pritesh Parmor, Vihol Poza, Vaishnavi Chauhan (2008) đã sử dụng 23 cặp mồi SSR trên 25 giống cà chua có 13% mồi không biểu hiện khuếch đại PCR, 40 alen được thể hiện, hệ số PIC thấp 0,08 ở mồi SSR 304 và hệ số PIC là 0,4 khi sử dụng với bảng mồi khác. Liwang Liu, Yan wang, Yi QinGong (2007) đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD, ISSR và SSR để kiểm tra độ tinh khiết di truyền giống lai của hai dòng cà chua thương mại là giống Hezuo 90 và Sufen số 8 và các dòng tương ứng được sàng lọc với 148 cặp mồi RAPD và mồi ISSR và 49 mồi SSR. Subramarian Geethanjali, Kai-Yichen, David Son V. patrana and Jaw-Fen Wang (2009) xác định tính đa hình của các locus được đánh giá trong một bảng điều khiển của 16 kiểu gen bao gồm Solanum lycopersicum và họ 36 hàng hoang dã của nó. Hai mươi-một dấu SSR bắt nguồn từ 13 dòng vô tính BAC được đa hình ở 2 loại cà chua là: West Virginia 700 và Hawaii 7996 và đã được lập bản đồ bằng cách sử dụng một số dòng cận giao tái tổ hợp có nguồn gốc từ giao phối chéo. Các dấu hiệu được phân phối trải rộng khắp các nhiễm sắc thể tổng chiều dài 117,6 cM theo thứ tự của các dòng vô tính BAC gốc. Một chỉ tiêu (QLT) chủ yếu liên quan đến tính kháng bệnh héo vi khuẩn đã được ánh xạ trên nhiễm sắc thể 6 ở vị trí tương tự của các báo cáo T-6 locus. 37 Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu - Xác định liều chiếu xạ thích hợp với hạt cà chua. - Đánh giá khả năng sống và sinh trưởng của hạt cà chua chiếu xạ M1. - Đánh giá, chọn lọc đột biến ở thế hệ M2. - Nghiên cứu các đột biến ở thế hệ M 3 về năng suất, chất lượng và bằng các chỉ thị phân tử. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu thực vật Hạt của các giống cà chua Cu ba là: Carucha, Delmay, Maybel 2.2.2. Hoá chất - Một số hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, … bao gồm CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymerase, Ethanol, 2Propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Ribonuclease A, Formaldehyde 37%, Ethylrium Bromua, Bind Silane, Sigma Cote, Acrylamide, Bis- Acrylamide, Sodium thiosunfate, Urea. - Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotit triophosphat (dNTPs) của Sigma, Taq-ADN Polymerase của Fementas; 38 - 24 mồi SSR cà chua TT Marker Chro Repeat moso type Primer me 1 SSR51 1 (ACAA)6 F: CTACCCTGGTCTTGGTGGAA P: AAAGGATGCTCTAGCTTCTCCA 2 SSR135 1 (ATT)6 F: TGATCGCTTGTGTCCACCTA P: AAAGGAAGTGATGGAAAGCG 3 SSR66 2 (ATA)8 F: TGCAACAACTGGATAGGTCG P: TGGATGAAACGGATGTTGAA 4 SSR96 2 (AT)12 F: GGGTTATCAATGATGCAATGG P: CCTTTATGTCAGCCGGTGTT 5 SSR111 3 (TC)6(TC F: TTCTTCCCTTCCATCAGTTCT TG)6 P: TTTGCTGCTATACTGCTGACA 6 SSR11 3 (CAG)6 F: CCTTCAATTGACCTCCCTAC P: GCATCTGGAATTAGAGGCG 7 SSR43 4 (TAC)7 F: CTCCAATTGGGAATAACA P: TTAGGAAGTTGCATTAGGCCA 8 SSR593 4 (TAC)7 F: TGGCATGAACAACCAAT P: AGGAAGTTGCATTAGGCCAT 9 SSR115 5 (AT)16 F: CACCCTTTATTCAGATTCCTCT 39 P: ATTGAGGGTATGCAACAGCC 10 SSR590 5 (TC)6(AC) F: TCTCAAAGTCGTTCCTTCTTGA 4 P: GGAAGAGAAACGCGGACATA 11 SSR47 6 (AT)14 F: TCCTCAAGAAATGAAGCTCTG P: CCTTGGAGATAACAACCACAA 12 SSR578 6 (ACC)6(A F: ATTCCCAGCACAACCAGACT TC)5 P: GTTGGTGGATGAAATTGTG 13 SSR285 7 (TTAT)2( F: AGTGGCTCTCACCTACTGCG AT)6 P: CAATTCTCAGGCATGAAACG 14 SSR45 7 (AAT)14 F: TGTATCCTGGTGGACCAATG P: TCCAAGTATCAGGCACACCA 15 SSR38 8 (TCT)8 F: GTTTCTATAGCTGAAACTCAACCTG P: GGGTTCATCAAATCTACCATCA 16 SSR594 8 (TCT)8 F: TTCGTTGAAGAAGATGATGGTC P: CAAAGAGAACAAGCATCCAAGA 17 SSR73 9 (AG)2(AG F: TGGGAAGATCCTGATGATGG A)7(TAGT GA)2 18 SSR383 9 (ATA)9 P: TTCCCTTTCCTCTGGACTCA F: ATTGTACAAAGACCCGTGGC P: GTTGCACACTGGATCAATGC 19 SSR4 10 (CGG)7 F: TTCTTCGGAGACGAAGGGTA 40 P: CCTTCAATCCTCCAGATCCA 20 SSR248 10 (TA)21 F: GCATTCGCTGTAGCTCGTTT P: GGGAGCTTCATCATAGTAACG 21 SSR80 11 (TTTCAA F: GGCAAATGTCAAAGGATTGG )2(GTAC AA)2(CA P:AGGGTCATGTTCTTGATTGTCA A)7 22 SSR46 11 (AT)14 F: CCGAGGCGAATCTTGAATAC P:GCACCATCTCTTGTGCCTCT 23 SSR20 12 (GAA)8 F: GAGGACGACAACAACAACGA P: GACATGCCACTTAGATCCACAA 24 SSR124 12 (CACC)2( F: TCAATCCATCACACCTTGGA GA)7 P :GAGGAAGAAGACCACGCAAA 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chiếu xạ gây đột biến Sử dụng nguồn chiếu xạ tia gamma Co 60. Để tìm liều chiếu xạ thích hợp đối với cà chua một thí nghiệm xác định liều được thiết lập 1000 hạt/liều ở các liều: 0, 5, 7, 10,15, 20 và 25 Kr. 2.3.2. Phương pháp đánh giá ngoài đồng ruộng 1000 hạt mỗi giống được chiếu xạ và giống đối chứng, gieo trồng để đánh giá sinh trưởng phát triển của cây ở thế hệ M1. Sau khi gieo 14 ngày 41 cây con được đem trồng ở ruộng thí nghiệm, khoảng cách trung bình 35 x 40 cm. Quan sát và đánh giá sơ bộ về khả năng sinh trưởng, phát triển của cây chiếu xạ và cây đối chứng. Đối với cây chiếu xạ, thu hạt của những quả đầu để tạo quần thể hạt M2. Lượng phân sử dụng và cách bón: Lượng phân bón/ 1000m2: 20 kg urea, 50 kg super lân, 20 kg clorua kali, 12 kg calcium nitrat, 50 kg NPK 16-16-6 (dành cho giống thấp cây), 1 tấn phân chuồng hoai và 100 kg vôi bột  Cách bón: Bón lót (3-7 ngày trước khi trồng): Toàn bộ phân chuồng, vôi bột và super lân, 3 kg clorua kali, 2 kg calcium nitrat và 10-15 kg NPK 16-16-6. Vôi rải đều trên mặt đất trước khi cuốc đất lên luống, phân chuồng hoai và lân rải đều trên mặt luống rồi xới đều. Bón thúc đợt 1 (15 ngày sau khi trồng): 4 kg urea, 3 kg clorua kali, 10 kg 16-16-8 và 2 kg calcium nitrat. Bón phân vào lỗ giữa 2 gốc cà. Bón thúc đợt 2 (35-40 ngày sau cấy, khi cây đã đậu trái đều): 6 kg urea, 5 kg clorua kali, 10-15 kg 16-16-8 và 2 kg calcium nitrat. Bón phân vào lỗ giữa 2 gốc cà. Bón thúc đợt 3 (60-65 ngày sau trồng, bắt đầu thu trái rộ): 6 kg urea, 5 kg clorua kali, 10-15 kg 16-16-8 và 3 kg calcium nitrat. Cách bón vẫn như trên. 42 Hạt M2 được gieo trồng để chọn các biến dị có lợi về năng suất, chất lượng. Mỗi giống cà chua gieo 1000 hạt. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên 3 lần lặp lại cho mỗi công thức. Các chỉ tiêu đánh giá: - Khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cà chua M1: Màu sắc thân, màu sắc lá, mức độ phân nhánh, hiều cao cây, Thời gian trồng đến nở hoa 50%, số quả. - Đánh giá, chọn lọc các biến dị ở thế hệ M2: Chiều cao cây, màu sắc lá, hình dạng quả, kích thước quả, số cây khác dạng gốc. - Đánh giá các chỉ tiêu năng suất và yếu tố cấu thành năng suất: + Số quả/cây: + Khối lượng quả. + Năng suất lý thuyết. NSLT = Mật độ x số quả/cây x khối lượng trung bình quả - Đánh giá các chỉ tiêu về năng suất: + Trọng lượng thịt quả + Tỉ lệ giữa trọng lượng thịt quả/ trọng lượng trung bình quả. + Độ Brix: Đo bằng Brix kế. 2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN tổng số Phương pháp tách chiết ADN tổng số dựa theo phương pháp của P. ObaraOkeyo & Kako (1998)[31] có cải tiến. Quy trình tách chiết như sau: - Nghiền 0,3g mẫu lá trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ thành dạng bột mịn, cho vào ống eppendoff 2ml - Bổ sung 800ml đệm chiết CTAB có nhiệt độ 60oC và 60ml dung dịch SDS 10% vào mẫu rồi cho vào máy vortex đảo đều. - Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng. 43 - Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu sau đó đảo đều. - Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 15 phút. Hút dịch nổi phía trên sang ống eppendoff mới, bỏ cặn. - Bổ sung 2µl RNase (nồng độ 10µg/ml) vào dung dịch thu được, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1giờ - Bổ sung 2- propanol với tỉ lệ 1:1 về thể tích để thu tủa ADN. Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 10 phút để thu tủa. - Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa ADN bằng ethanol 70% rồi làm khô ADN ở nhiệt độ phòng. - Hoà tan ADN bằng đệm TE. Kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN bằng cách điện di 5µl dung dịch ADN trên gel agarose 1% với thang nồng độ ADN chuẩn là 25µg. 2.3.4. Phương pháp PCR Phương pháp PCR được tiến hành với các thành phần phản ứng như sau: ADN mẫu 25ng, dung dịch đệm PCR 1X, MgCl2 2mM, dNTP 10µM, Taq polymerase 1U, mồi SSR 1µM và bổ sung H 2O để tổng thể tích phản ứng là 15µl. Chu trình nhiệt phản ứng PCR như sau: Bước Phản ứng Nhiệt độ(0C) 1 Biến tính 95 2 Biến tính 95 3 Bắt cặp môi 35 4 Kéo dài mạch 72 5 Hoàn tất kéo dài 72 6 Kế thúc phản ứng 4 2.3.5. Điện di sản phẩm PCR Thời gian 5 phút 1 phút 1 phút 30 giây 1phút 45 giây 7 phút ∞ Chu kỳ 1 35 1 1 Sản phẩm PCR sau khi biến tính được điện di trên gel polyacrylamide biến tính với các bước chuẩn bị như sau: 44 + Chuẩn bị kính: - Kính ngắn được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% ba lần, xử lý chống dính bằng dung dịch Sigma Cote sau đó loại bỏ Sigma Cote dư thừa bằng lau ethanol 95% hai lần. - Kính dài được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, rồi xử lý dính bằng Bind Silane (bổ sung 2µl Bind Silane vào 1ml dung dịch có chứa 95% ethanol + 5% glacial acetic acid), sau đó lau lại kính bằng ethanol 95% hai lần. + Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 38cm): - Dung dịch acrylamide 4,5%: 70ml - Dung dịch APS 10%: 700µl - Dung dịch TEMED: 70µl Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. + Sau 1-2 giờ gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành tiền điện di ở công suất 80W, cho đến khi nhiệt độ trên gel đạt đến 550C thì dừng lại và bắt đầu tra sản phẩm PCR vào các giếng. Tiếp tục điện di với công suất 65W, nhiệt độ trên gel là 50 0C - 550C trong thời gian 55- 60 phút. 2.3.6. Phương pháp nhuộm Ethidium Bromide với gel polyacrylamide Hoà Ethidium Bromide1% vào khay. Đặt bản gel đã điện di vào và điều chỉnh sao cho ethidium Bromide ngập hết bản gel, sau đó đậy khay trong 15 phút. 45 Lấy gel ra rửa lại sạch bằng nước. 2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu - Sử lý số liệu nông sinh học bằng các phần mềm: EXCEL, IRRISTAT. - Để xác định quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu, các kết quả thu được từ quá trình điện di, sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN. - Số 1: các alen có xuất hiện băng ADN; - Số 0: các alen không xuất hiện băng ADN; - Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các alen (khuyết số liệu); Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi. - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa hình của các allele ở từng locus SSR. Hệ số PIC được tính theo công thức của Nei (Nei, 1973) như sau: PIC =1 - Pi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). - Số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (I) (theo Jaccard) và thành lập cây quan hệ chủng loại. - Khoảng cách di truyền (D) được tính theo công thức: D=1-I - Tỷ lệ dị hợp (H%) của mỗi mẫu được tính theo công thức: H%  X MY 46 Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 alen/1 locus SSR M: là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu Y: là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN - Tính tỷ lệ khuyết số liệu được tính bằng công thức: M%  Trong đó: Z M Z là tổng số mẫu dị hợp tử M là tổng số mẫu thu được. 47 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định liều chiếu xạ thích hợp đối với hạt cà chua Ở mỗi loài thực vật có các ngưỡng gây đột biến chiếu xạ khác nhau và trên các vật liệu chiếu xạ khác nhau của cùng một loài thì các ngưỡng gây đột biến chiếu xạ cũng khác nhau. Chính vì vậy việc xác định liều chiếu xạ thích hợp đối với các loài thực vật là việc cần thiết trong phương pháp chọn giống bằng gây đột biến. Để xác định ngưỡng của liều chiếu xạ tia gamma nguồn Co 60 đối với hạt cà chua có nguồn gốc CuBa, chúng tôi tiến hành chiếu 1000 hạt cà chua / 1 liều ở các liều chiếu 0Kr (ĐC), 5Kr, 7Kr, 10Kr, 15Kr, 20Kr và 25Kr. Các hạt cà chua này được gieo trên đất ẩm và được theo dõi, đánh giá tỷ lệ nảy mầm của hạt sau 10 ngày để xác định mức độ nhạy cảm của hạt cà chua đối với bức xạ tia gamma từ đó xác định được liều chiếu xạ thích hợp cho hạt cà chua đồng thời xác định liều gây chết 50% (LD50) ở cà chua. Kết quả thu được ở bảng 3.1 và đồ thị 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ tới sự nảy mầm của hạt Tỷ lệ nẩy mầm(%) Giống ĐC 5Kr 7Kr 10Kr 15Kr 20Kr 25Kr Carucha 92,6 87,2 69,4 57,4 37,1 11,2 3,5 Delmay 95,3 89,3 79,5 68,5 42,1 13,1 5,6 Maybel 93,7 82,6 72,8 65,3 37,9 12,4 4,2 48 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng bức xạ tia gamma tới tỷ lệ nảy mầm Kết quả theo dõi cho thấy khi chiếu xạ bằng tia gamma đã ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt cà chua và liều chiếu xạ càng tăng thì tỷ lệ nảy mầm càng giảm. Ở công thức không chiếu xạ (ĐC) tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua các giống CuBa khá cao đạt trên 90%. Khi bị chiếu xạ tỷ lệ nảy mầm của các hạt cà chua giảm rõ rệt, ở các liều chiếu xạ thấp 5Kr, tỷ lệ nảy mầm của các hạt cà chua giảm từ 5 -10% nhưng khi liều chiếu xạ tăng từ 7 – 25Kr tỷ lệ nảy mầm của các hạt giống giảm mạnh. Ở liều chiếu 15Kr tỷ lệ nảy mầm của hạt giống đều đạt dưới mức 50% nên liều 15Kr được xác định là liều gây chết 50% (LD50). Ở công thức chiếu 20 – 25Kr thì tỷ lệ 49 nảy mầm của hạt cà chua ở cả 3 giống Carucha, Delmay và Maybel là rất thấp, các hạt cà chua có hiện tượng chỉ nứt nanh nhưng hạt không nảy mầm hoặc hạt nảy mầm nhưng không có khả năng phát triển thành cây. Như vậy, liều 10Kr được xác định là liều tối thích vì ở liều chiếu xạ này làm giảm khả năng sinh trưởng của cây cà chua khoảng 30% (Amano, 2004). Chiếu xạ không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm mà còn ảnh hưởng tới chiều cao cây con. Khi tăng liều chiếu xạ thì chiều cao cây con giảm dần. Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến chiều cao cây con (sau 3 tuần gieo) Chiều cao trung bình của cây con (cm) Giống ĐC 5Kr 7Kr 10Kr 15Kr 20Kr 25Kr Carucha 8,5 8,4 8,2 8,0 2,0 1,8 1,6 Delmay 8,6 8,5 8,3 7,9 2,0 1,8 1,6 Maybel 8,6 8,5 8,3 7,8 2,0 1,7 1,5 50 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng bức xạ tia gamma tới chiều cao cây con Từ bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy chiều cao cây con của các hạt cà chua nảy mầm tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ, liều chiếu xạ càng tăng thì chiều cao cây càng giảm. Ở các liều chiếu xạ thấp 5 -10Kr chiều cao cây con có giảm nhưng không rõ rệt dao động trong khoảng 7,8 – 8,5cm. Ở liều chiếu xạ 10 – 15Kr chiều cao cây con giảm mạnh từ 5,6 – 6cm. Đặc biệt ở liều chiếu từ 15 – 25Kr chiều cao cây con giảm chỉ còn 1,5 – 2,0cm, đặc biệt các cây con rất yếu và bị chết dần. Do đó các cây con ở các liều chiếu này bị loại bỏ khỏi thí nghiệm. Thông qua tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua và chiều cao cây con sau 3 tuần gieo của các giống cà chua nguồn gốc CuBa bị chiếu xạ và không chiếu xạ, chúng tôi nhận thấy liều chiếu xạ thích hợp với hạt cà chua là dưới 10Kr. Chúng tôi tiến hành lấy các 51 cây con ở các liều chiếu 5 – 10Kr đem trồng tại ruộng tạo quần thể M1để nghiên cứu tiếp. Hình 3.3. Cà chua ở giai đoạn cây con 3.2. Đặc điểm nông sinh học và khả năng sinh trưởng, phát triển của các giống cà chua thế hệ M1. 3.2.1. Đặc điểm nông sinh học Đặc điểm nông sinh học phụ thuộc vào bản chất di truyền của giống nên dựa vào đặc điểm nông sinh học ta có thể nhận biết và phân biệt được các dòng, giống cây trồng với nhau. Do vậy để tìm hiểu sự ảnh hưởng của bức xạ tia gamma nguồn Co60 đến các giống cà chua có nguồn gốc CuBa chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của chúng. Để đánh giá đặc điểm nông sinh học của các giống cà chua chiếu xạ và không chiếu xạ chúng tôi tiến hành đánh giá thông qua một số chỉ tiêu như: Màu sắc thân, màu sắc lá và mức độ phân cành. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Một số đặc điểm nông học của quần thể M1 52 Giống Màu sắc Màu sắc lá thân Carucha Delmay Maybel Mức độ phân cành ĐC Xanh nhạt Xanh nhạt Nhiều 5Kr Xanh nhạt Xanh nhạt Nhiều 7Kr Xanh nhạt Xanh nhạt Nhiều 10Kr Xanh nhạt Xanh nhạt Nhiều ĐC Xanh thẫm Xanh thẫm Ít 5Kr Xanh thẫm Xanh thẫm Ít 7Kr Xanh thẫm Xanh thẫm Ít 10Kr Xanhthẫm Xanh thẫm Ít ĐC Xanh nhạt Xanh thẫm Nhiều 5Kr Xanh nhạt Xanh thẫm Nhiều 7Kr Xanh nhạt Xanh thẫm Nhiều 10Kr Xanh nhạt Xanh thẫm Nhiều Kết quả quan sát màu sắc thân cho thấy các giống khác nhau có màu sắc thân khác nhau. Khi có sự tác động của tia bức xạ thì màu sắc thân của các giống ở thế hệ M1 không có sự thay đổi, cụ thể: Giống Carucha và Maybel có thân màu xanh nhạt, ở các liều chiếu xạ thì màu sắc thân vẫn màu xanh nhạt. Giống Delmay cả đối chứng và các liều chiếu xạ đều có thân màu xanh thẫm. Màu sắc lá thể hiện khả năng sinh trưởng, mức độ thích ứng của giống. Nhưng ở thế hệ M1 thì cả đối chứng và ở các liều chiếu xạ màu sắc lá không có sự sai khác nhau. Giống Carucha và Delmay lá đều có màu sắc lá là xanh nhạt, còn giống Maybel lá lại có màu xanh thẫm. 53 Mức độ phân nhánh của các dòng cà chua được đánh giá ở các mức độ: ít- trung bình – nhiều. Mức độ phân nhánh không chỉ phụ thuộc vào đặc điểm di truyền mà còn phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng. Đánh giá mức độ phân nhánh ta có thể đánh giá được mức độ thích ứng của các dòng cà chua sau khi chiếu xạ. Qua bảng 3.3 cho thấy chiếu xạ chưa ảnh hưởng tới sự phân nhánh ở các giống cà chua. Do vậy, ở giống Carucha và giống Maybel mức độ phân nhánh nhiều thì các liều chiếu xạ cũng thể hiện khả năng phân nhánh nhiều và chứng tỏ hai giống này có khả năng thích ứng cao với điều kiện ở Việt Nam. Giống Delmay có mức độ phân nhánh ít nên các ở các liều chiếu xạ cũng có khả năng phân nhánh ít và khả năng thích ứng của chúng thấp hơn giống Carucha và Maybel. Mặc dù có sự tác động của tia bức xạ nhưng đặc điểm màu sắc thân, màu sắc lá và mức độ phân cành của các giống đều không thay đổi, sở dĩ có điều này là vì ở thế hệ M1 thì đột biến thường chưa được biểu hiện ra kiểu hình do chúng bị các gen trội tương ứng át chế sự biểu hiện. Tuy nhiên, qua quá trình theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của quần thể M1 cho thấy có sự xuất hiện những cây sinh trưởng không bình thường như còi cọc, ra hoa rất sớm nhưng không đậu quả, cây có bộ lá màu xanh nhạt và có những cây không ra hoa, những cây sinh trưởng không bình thường xuất hiện nhiều ở liều 10Kr. Nhìn chung, phần lớn các cây chiếu xạ thường có thời gian nở hoa và chín chậm hơn so với cây đối chứng. 3.2.2. Khả năng sinh trưởng của các giống cà chua thế hệ M1 Để xác định sự ảnh hưởng của bức xạ tia gamma tới khả năng sinh trưởng, phát triển của các giống cà chua nguồn gốc CuBa thế hệ M1, Chúng tôi tiến hành theo dõi một số các chỉ tiêu là: Số cây sinh trưởng kém, thời gian từ trồng đến ra hoa 50% và tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu 54 hoạch của các giống. Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.4a, 3.4b, 3.4c. Bảng 3.4. Ảnh hưởng bức xạ tia gamma đến sinh trưởng quần thể M1 Chỉ tiêu Số cây trưởng sinh kém (%) Thời gian từ trồng đến ra hoa 50% (ngày) Tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch (%) Giống Liều chiếu ĐC 5Kr 7Kr 10Kr Carucha 0,5 6,3 12,2 18,6 Delmay 0,6 6,2 11,8 16,0 Maybel 0,5 5,9 11,9 25,3 Carucha 50 50 50 55 Delmay 50 50 50 55 Maybel 50 50 50 55 Carucha 98,8 91,4 85,2 77,5 Delmay 98,6 91,0 86,8 80,4 Maybel 98,4 90,6 86,3 80,1 55 Hình 3.4a. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tia gamma tới số cây sinh trưởng kém ở thế hệ M1 56 Hình 3.4b. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tia gamma tới thời gian từ trồng tới ra hoa 50% ở thế hệ M1 Hình 3.4c. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tia gamma tới tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch ở thế hệ M1 Từ bảng 3.4 và hình 3.3a cho thấy khi liều chiếu xạ tăng thì số cây sinh trưởng kém ở quần thể M1cũng tăng. Ở công thức đối chứng của cả 3 giống, số cây sinh trưởng kém rất thấp chỉ đạt 0,5 – 0,6 %. Ở các công thức chiếu xạ thì số cây sinh truởng kém tăng lên: Giống Carucha ở liều 5Kr số cây sinh trưởng kém là 6,3% nhưng ở liều 7Kr số cây sinh trưởng kém tăng gần gấp đôi 12,2% và ở liều 10Kr lên tới 18,6%. Số cây sinh trưởng kém của giống Delmay cũng tăng tương đương với giống Carucha và ở liều 10Kr là 16%. Riêng giống Maybel ở liều 5Kr tăng thấp nhất so với giống Carucha và Delmay nhưng ở liều 10Kr thì số cây sinh trưởng kém lại cao nhất là 25,3%. 57 Thời gian từ trồng đến ra hoa 50% là số ngày từ khi trồng tới khi có 50% số cây ra hoa. Thời gian này cây vừa sinh trưởng sinh dưỡng đồng thời chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực. Ở thế hệ M1, đối với các liều chiếu xạ thấp 5Kr và 7Kr thì bức xạ tia gamma không làm ảnh hưởng tới thời gian từ trồng đến ra hoa 50% (50 ngày), ở liều chiếu xạ 10Kr bức xạ tia gamma có ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cả 3 giống cà chua giai đoạn từ trồng đến ra hoa 50%, làm cho thời gian ra hoa 50% kéo dài hơn so với đối chứng khoảng 5 ngày. Tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch là số cây còn sống và có quả ở thời điểm thu hoạch. Qua bảng 3.4 và hình 3.3c cho thấy các giống khác nhau có tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch khác nhau và cùng một giống nhưng ở các liều chiếu xạ khác nhau thì tỷ lệ số cây sống sót đến thời điểm thu hoạch khác nhau. Khi không bị chiếu xạ tỷ lệ sống sót của cả 3 giống đều cao đạt trên 98%. Khi có tác động của tia bức xạ thì tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch giảm dần. Giống Carucha ở liều 5Kr đạt 91,4%, ở liều 7Kr giảm xuống còn 85,2% và ở liều 10Kr chỉ còn 77,5%. Giống Delmay tỷ lệ sống sót ở thời điểm thu hoạch ở liều 5Kr đạt 91%, nhưng ở liều 7Kr thì tỷ lệ sống sót lại giảm còn 86,8% và ở liều 10Kr chỉ còn 80,4% so với đối chứng. Ở liều 5Kr tỷ lệ sống sót đến thời điểm thu hoạch là 90,4%, liều 7Kr đạt 86,3% và ở liều 10Kr là 80,1%. Hạt của cây M1 được thu trên cơ sở chọn lọc những cây sinh trưởng tốt và từ những quả cà chua gốc (2 quả/cây) để hỗn lại dùng làm giống tạo quần thể hạt thế hệ M2. 3.3. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và chọn lọc những biến dị ở quần thể M2 3.3.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của quần thể M2 58 Quần thể M2 được gieo trồng theo phương pháp trồng cà chua truyền thống từ đó đánh giá các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các công thức chiếu xạ so với đối chứng không chiếu xạ. Để đánh giá các đặc điểm sinh trưởng và phát triển ở quần thể M2 của các dòng cà chua chúng tôi tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu là chiều cao cây, thời gian trồng đến nở hoa và số quả/cây. Kết quả đánh giá được dẫn ra ở bảng 3.5 và đồ thị 3.4. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tia bức xạ tới khả năng sinh trưởng, phát triển của quần thể M2 Chỉ tiêu Giống Liều chiếu % so % so ĐC 5Kr với 10Kr với 58 ĐC 5,5 60 ĐC 9,1 55 Delmay -3,0 67 0 79 21,5 Maybel 66 -5,7 67 -4,3 73 4,3 35 35 0 34 -2,9 35 0 Delmay 34 35 2,9 35 2,9 34 0 nở Maybel 34 34 0 33 -2,9 33 -2,9 Cao cây Carucha (cm) 7Kr với 55 ĐC 0 67 65 70 % so LSD5% = 6,26 CV(%) = 5,7 Thời Carucha gian trồng đến hoa LSD5% = 1,0 CV(%) = 1,8 59 Số quả/cây Carucha 48 50 4,2 52 8,3 52 8,3 Delmay 48 50 4,2 52 8,3 52 8,3 Maybel 48 50 4,2 40 -16,7 48 0 LSD5% = 1,46 CV(%) = 1,7 Chiều cao cây là đặc điểm di truyền của giống , từ bảng 3.5 cho thấy chiều cao cây của các giống đối chứng là khác nhau trong đó giống Maybel có chiều cao cây cao nhất đạt 70cm, sau đó là giống Delmay và thấp nhất là giống Carucha (55cm). Ở các liều chiếu xạ khác nhau thì chiều cao cây của các giống cũng khác nhau. Khi liều chiếu xạ ở 5Kr thì chiều cao cây có sự thay đổi. Giống Carucha chiều cao cây không tăng mà bằng với đối chứng (55cm). Giống Delmay và Maybel lại giảm từ 3,0 – 5,7% so với đối chứng. Ở liều chiếu xạ 7Kr chiều cao của giống Carucha tăng 5,5%, giống Delmay lại không tăng mà bằng với đối chứng và giống Maybel chiều cao cây giảm 4,3%. Chiều cao cây của cả 3 giống đều tăng khi ở liều chiếu xạ 10Kr, giống Carucha tăng 9,1% so với đối chứng, giống Delmay tăng 21,5% so với đối chứng và giống Maybel tăng 4,3% so với đối chứng. Qua bảng 3.5 cho thấy chiếu xạ tác động tới thời gian trồng đến ra hoa một cách không ý nghĩa hay chiếu xạ không làm thay đổi thời gian từ trồng đến ra hoa của các giống mà nó phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của giống. Do đó, phần lớn cây của các liều chiếu xạ ở thế hệ M2 sinh trưởng, phát triển bình thường có thời gian trồng đến nở hoa tương đương với đối chứng khoảng 33 – 35 ngày. Giống Carucha ở liều 7Kr thời gian trồng đến nở hoa sớm hơn đối chứng 1 ngày giảm 2,9% so với đối chứng. Ở liều 10Kr thời gian trồng đến nở hoa bằng với đối chứng là 35 ngày. Giống 60 Delmay ở liều 7Kr thì thời gian trồng đến nở hoa nhiều hơn đối chứng 1 ngày tăng 2,9% và ở liều 10Kr cũng bằng với đối chứng. Giống Maybel ở cả liều 7Kr và 10Kr thời gian trồng đến nở hoa đều thấp hơn đối chứng 1 ngày và giảm 2,9% . Số quả/cây là đặc tính di truyền của giống và phụ thuộc rất lớn vào điều kiện ngoại cảnh cũng như kỹ thuật chăm sóc, nó quyết định đến năng suất. Từ bảng 3.5 cho thấy tỷ lệ số quả/cây của cây đối chứng ở cả 3 giống là bằng nhau, ở các liều chiếu xạ thì tỷ lệ số quả/cây có sự thay đổi. Ở liều 7Kr và 10Kr ở giống Carucha và Delmay tỷ lệ số quả/cây đều tăng và bằng nhau là 8,3% so với đối chứng. Riêng giống Maybel ở liều chiếu xạ 7Kr tỷ lệ số quả/cây giảm 16,7% so với đối chứng, ở liều chiếu 10Kr tỷ lệ số quả / cây lại bằng với đối chứng nhưng thấp hơn giống Carucha và Delmay. Thông qua các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của thế hệ M2 cho thấy, sự xuất hiện các biến dị ở thế hệ M2 đều không theo quy luật. 3.3.2. Chọn lọc các biến dị ở quần thể M2 Biến dị là các đặc điểm sai khác của thế hệ sau so với bố mẹ, các đặc điểm sai khác này có thể là các đặc điểm về hình thái hoặc về cấu tạo sinh lý. Từ quần thể M2 gồm 1586 cây thuộc giống Carucha, 1794 cây thuộc giống Delmay và 1666 cây thuộc giống Maybel, để chọn lọc được các biến dị của các dòng cà chua đột biến ở quần thể M2 chúng tôi dựa trên các đặc điểm sai khác của các cây đột biến so với cây đối chứng. Sau đó thống kê lại, chúng tôi đã thu được một số các biến dị về chiều cao cây, màu sắc lá, hình dạng hoa, hình dạng quả, kích thước quả và đếm số lượng cây khác biệt với cây đối chứng xuất hiện ở các liều chiếu xạ khác nhau ở các giống, từ đó xác định được tần số xuất hiện đột biến ở từng giống cà chua. Qua quá trình theo dõi thu được kết quả về hình thái như sau. 61 Bảng 3.6. Các dạng đột biến hình thái ở thế hệ M2 Số lượng cây đột biến Các dạng đột Carucha biến Delmay Maybel ĐC 5Kr 7Kr 10Kr ĐC 5Kr 7Kr 10K ĐC 5Kr 7K 10Kr Chiều cao cây 0 1 3 3 0 0 2 3 0 1 2 3 Màu sắc lá 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 Hình thái hoa 0 0 1 1 0 0 1 2 0 1 1 1 Hình dạng quả 0 0 1 2 0 0 1 2 0 0 1 1 Kích thước quả Dạng cây khác 0 1 2 2 0 1 1 1 0 0 1 2 ĐC Tần số đột biến 0 1 5 6 0 1 4 4 0 1 5 6 (%) 1,9 1,3 1,9 Kết quả theo dõi cho thấy các giống đã có sự xuất hiện các đặc điểm sai khác so với đối chứng. Số cây khác biệt chủ yếu xuất hiện ở các liều 7 Kr và 10Kr, còn ở liều 5Kr nhận thấy có rất ít sự khác biệt về hình thái của các giống so với các giống đối chứng. Ở công thức đối chứng không chiếu xạ của cả 3 giống cây phát triển bình thường, không xuất hiện bất cứ biến dị nào. Giống Carucha từ 3 liều chiếu xạ thu được 30 dòng, giống Delmay thu được 23 dòng và giống Maybel thu được 32 dòng đột biến về kiểu hình. Biến dị về chiều cao cây phần lớn là biến dị gây cao cây, các cây biến dị này có chiều cao hơn hẳn các cây đối chứng và các cây ở các liều chiếu xạ. Biến dị về màu sắc lá thường làm cho lá từ xanh đậm thành xanh nhạt hoặc vàng. Ngoài các biến dị về chiều cao và màu sắc lá còn có các biến dị về hình dạng quả thì biến đổi từ dạng quả tròn thành dạng hơi dẹt và có múi, 62 biến dị làm tăng số múi ở quả hoặc tăng số vách ngăn từ 2 đến 3 hoặc 4 ngăn. Kích thước quả của các cây đột biến tăng hơn so với các cây đối chứng. 63 Carucha 5Kr Carucha 7Kr Một số sai khác về hình dạng lá 64 Một số sai khác về màu sắc lá Hình 3.5. Các dạng đột biến ở thế hệ M2 Như vậy thế hệ M2 đã xuất hiện các dòng cà chua đột biến có những sai khác về hình dạng so với các giống cà chua CuBa. Hạt của các giống cà chua CuBa này có khả năng chịu bức xạ kém hơn các giống cà chua Micro Tom (Chiaki Matsukura và cs, 2007), tuy nhiên ở liều chiếu thấp, các giống cà chua Cuba vẫn xuất hiện đột biến với tần số kiểu hình cao nhất đạt 1,9%. Để chọn được các dòng đột biến có triển vọng cho năng suất, chất lượng cao, chúng tôi tiếp tục chọn các cá thể sinh trưởng, phát triển tốt, cao cây và quả to để tạo quần thể M3, sau đó đánh giá các đặc điểm nông sinh học ở thế hệ M3 3.5. Đặc điểm sinh trưởng, năng suất và chất lượng của các dòng cà chua đột biến ở quần thể M3 Từ quần thể M2 thu hạt của những cây có chiều cao cao hơn hẳn đối chứng , có kích thước và trọng lượng quả lớn, để hỗn sau đó gieo trồng tạo 65 quần thể M3. Để chọn được các dòng cà chua triển vọng ở thế hệ M3 chúng tôi đánh giá trên một số chỉ tiêu: chiều cao cây, năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của các giống cà chua ở các liều chiếu xạ khác nhau. 3.5.1. Đánh giá về chiều cao cây ở thê hệ M3 Ở thế hệ M3 các dòng cà chua của các giống đều sinh trưởng tương đối đồng đều, kết quả đánh giá về chiều cao cây ở thế hệ M3 được trình bày trong bảng 3.7 Bảng 3.7. Chiều cao cây ở thế hệ M3 Giống ĐC 5Kr Chiều cao cây (cm) % so 7Kr % so 10Kr % so với với với 70 ĐC 27,3 68 ĐC 23,6 Carucha 55 60 ĐC 9,1 Delmay 67 75 11,9 72 7,5 75 11,9 Maybel 70 78 11,4 76 8,6 80 14,3 LSD5% = 5,86 CV(%) = 5. 66 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn chiều cao cây của các dòng cà chua chiếu xạ thế hệ M3 Kết quả phân tích chiều cao cây cho thấy ở thế hệ M3 chiều cao cây ở tất cả các liều chiếu xạ của các giống không chỉ cao hơn so với đối chứng mà còn cao hơn cả thế hệ M2, điều này cho thấy ở thế hệ M3 các đột biến cao cây đã được biểu hiện ra kiểu hình. Ở liều 5Kr chiều cao cây của giống Carucha đạt 60cm tăng 9,1% so với đối chứng, giống Delmay đạt 75cm tăng 11,9% và giống Maybel là 78cm tăng 11,4% so với đối chứng. Ở liều chiếu xạ 7Kr chiều cao cây của giống Carucha là 70cm tăng 27,3% so với đối chứng, giống Delmay cao cây đạt 72cm tăng 7,2% so với đối chứng nhưng thấp hơn liều chiếu xạ 5Kr 3cm, giống Maybel ở liều chiếu xạ 7Kr 67 là 76cm tăng 8,6% so với đối chứng nhưng thấp hơn chiều cao của liều 5Kr của giống là 2cm. Ở liều 10Kr chiều cao cây của cả 3 giống đều tăng, giống Carucha đạt 68cm tăng 23,6% so với đối chứng nhưng thấp hơn liều 7Kr, giống Delmay đạt 75cm tăng 11,9% so với đối chứng và giống Maybel chiều cao đạt cao nhất là 80cm tăng 14,3% so với đối chứng. 3.5.2. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng chiếu xạ ở thế hệ M3 Mục tiêu của công tác chọn tạo giống cây trồng không chỉ là tạo ra những dòng, giống cây trồng có khả năng sinh trưởng, phát triển và chống chịu tốt với điều kiện khí hậu của địa phương mà chọn giống cây trồng còn chọn ra các dòng, giống cây trồng có khả năng cho năng suất cao đáp ứng nhu cầu người dân. Để xác định được dòng cà chua đột biến từ nguồn vật liệu của CuBa là dòng có triển vọng cho năng suất cao chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu: Số quả/ cây; Khối lượng trung bình quả từ đó tính năng suất lý thuyết của các dòng chiếu xạ. Kết quả phân tích thu được ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng cà chua chiếu xạ ở thế hệ M3. Chỉ tiêu Giống Liều chiếu 5Kr 7Kr ĐC Số quả/cây 10Kr Carucha 48 52 52 50 Delmay 48 34 48 46 Maybel 48 38 44 46 68 LSD5% = 2,6 CV(%) = 3,3 Khối Carucha 83,84 66,83 83,52 84,24 Delmay 60,13 56,67 80,65 82,56 Maybel 48,93 64,28 56,36 55,62 CV(%) = 0,9 Năng suất Carucha 72,4 62,6 78,2 75,8 Delmay 51,95 34,7 69,7 63,36 Maybel 42,28 44,0 44,6 45,71 lượng trung bình quả (g) LSD5% = 0,99 lý thuyết (tấn/ha) LSD5% = 1,88 CV(%) = 2 69 Hình 3.7a. Đồ thị biểu diễn số quả/cây của các dòng cà chua M3 70 Hình 3.7b. Đồ thị biểu diễn khối lượng trung bình quả cà chua thế hệ M3 71 Hình 3.7c. Đồ thị biểu diễn năng suất lý thuyết của các dòng cà chua chiếu xạ thế hệ M3 Số quả /cây là đặc tính di truyền của giống, Nhưng khi có sự tác động của tia bức xạ đã làm cho số quả/cây thay đổi theo hướng kích thước quả tăng thì số lượng quả giảm, do vậy ở thế hệ M3 số quả /cây của các giống có sự thay đổi rõ rệt. Giống Carucha có số quả /cây tăng ở liều 5Kr và 7Kr đạt 52 quả/cây tăng 8,2% so với đối chứng, ở liều 10Kr số quả/cây còn 50 quả/cây tăng 4,2% so với đối chứng. Giống Delmay ở liều 5 Kr và 10Kr có số quả/cây giảm, ở liều 5Kr chỉ đạt 34 quả / cây giảm 29,2% so với đối chứng, ở liều 10Kr số quả /cây tăng hơn ở liều 5Kr nhưng vẫn giảm 4,2% 72 so với đối chứng. Giống Maybel ở cả 3 liều chiếu xạ thì số quả/cây đều giảm so với đối chứng từ 4,16 – 20,8%. Khối lượng trung bình quả là một trong các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá năng suất của giống. Thông qua bảng 3.8 và hình 3.7b cho thấy khối lượng quả của các giống khác nhau là khác nhau và ở các liều chiếu xạ khác nhau thì khối lượng quả cũng thay đổi. Giống Carucha ở liều 5Kr khối lượng quả đạt 66,83g giảm 20,35% so với đối chứng, ở liều 7Kr khối lượng quả bằng với đối chứng và ở liều 10Kr khối lượng quả đạt tăng 0,5% so với đối chứng. Đối với giống Delmay khi tăng liều chiếu xạ lên thì khối lượng quả tăng dần từ 55,67g – 82,56g. Giống Maybel ở liều 5Kr có khối lượng quả tăng mạnh đạt 64,28g tăng 31,4% nhưng ở liều 7Kr và 10Kr thì khối lượng quả lại giảm dần chỉ còn 55,62g giảm 13,7% so với đối chứng. Với mật độ trung bình 18000 cây/ha , chúng tôi xác định được năng suất lý thuyết của các dòng cà chua ở các liều chiếu xạ khác nhau để thấy được tiềm năng năng suất của của mỗi dòng từ đó chọn được các dòng triển vọng. Qua bảng 3.8 và hình 3.7c cho thấy dòng làm cho năng suất tăng lên cao nhất là dòng Delmay 7Kr đạt 69,7 tấn/ha tăng 34,2% so với đối chứng, ở liều 10Kr năng suất tăng lên 63,36 tấn/ha thấp hơn năng suất ở liều 7Kr nhưng tăng 32,96% so với đối chứng. Đối với giống Carucha dòng cho năng suất cao nhất so với đối chứng là ở liều 7Kr đạt 78,2 tấn/ha tăng 8,01% . Riêng giống Maybel năng suất đều tăng ở các liều chiếu xạ nhưng chênh lệch không nhiều so với đối chứng dao động trong khoảng 44,045,71 tấn/ha. 3.5.3. Đánh giá chất lượng quả của các dòng cà chua đột biến chiếu xạ ở thế hệ M3 73 Từ quần thể M3 chọn những cá thể tốt, điển hình để đánh giá chất lượng của các dòng cà chua chiếu xạ. Để đánh giá được chất lượng của quả cà chua chúng tôi dựa trên một số chỉ tiêu chất lượng là: Trọng lượng thịt quả; tỷ lệ giữa thịt quả/ trọng lượng quả; độ Brix. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu chất lượng quả cà chua thế hệ M3 % Giống ĐC 5Kr so với % 7Kr ĐC so với % 10Kr ĐC so với ĐC Carucha 72,34 Trọng lượng thịt quả (g) 54,12 -25,2 68,78 -4,9 Delmay 46,91 55,12 17,5 65,14 38,9 64,41 37,3 Maybel 38,38 49,61 29,3 43,31 12,8 45,72 19,1 Carucha Tỷ lệ giữa thịt quả/ trọng lượng quả (%) (M/P) 86,3 80,9 -6,3 82,4 -4,5 80,2 -7,1 Delmay 78,0 97,3 24,7 80,8 3,6 78,0 0 Maybel 78,9 77,2 -2,2 76,8 2,7 82,2 4,2 4,8 Độ Brix 4,3 5,0 8,7 5,1 10,8 67,52 -6,7 LSD5% = 1,77 CV(%) = 1,9 Carucha 4,6 74 Delmay 4,7 5,1 8,5 4,8 2,1 5,0 6,4 Maybel 4,6 4,9 6,5 4,8 4,3 4,9 6,5 Trọng lượng thịt quả là đặc tính di truyền của giống nên các giống khác nhau có trọng lượng thịt quả khác nhau. Đối với giống Delmay và Maybel trọng lượng thịt quả ở đối chứng thấp hơn giống Carucha nhưng ở các liều chiếu xạ trọng lượng thịt quả của các giống này đều tăng, ở liều 5Kr trọng lượng thịt quả của giống Delmay đạt 55,12g tăng 17,5% so với đối chứng, ở liều chiếu xạ 7Kr trọng lượng thịt quả đạt 65,14g tăng 38,9% nhưng ở liều 10Kr trọng lượng thịt quả lại giảm so với liều 7Kr nhưng vẫn cao hơn đối chứng 37,3%. Giống Maybel, ở liều 5Kr trọng lượng thịt quả đạt cao nhất là 49,61g tăng 29,3% so với đối chứng, ở liều 7Kr và 10Kr trọng lượng thịt quả thấp hơn so với liều 5Kr nhưng vẫn cao hơn đối chứng từ 12,8 -19,1% . Riêng với giống Carucha trọng lượng thịt quả của đối chứng cao đạt 72,34g nhưng ở liều 5Kr, 7Kr và 10Kr trọng lượng thịt quả lại giảm từ 4,9 – 25,2%. Chỉ số M/P là tỷ lệ giữa thịt quả/ trọng lượng quả. Tỷ lệ M/P càng cao thì quả càng chắc nghĩa là hàm lượng nước trong quả thấp. Trong thí nghiệm trên cho thấy giống Carucha có trọng lượng quả cao nhưng khi chiếu xạ ở cả liều 5Kr, 7Kr và 10Kr có trọng lượng thịt quả giảm dẫn đến tỷ lệ M/P giảm 4,5 – 7,1% so với đối chứng. Giống Delmay có trọng lượng quả thấp nhưng trọng lượng thịt quả cao hơn đối chứng nên ở liều 5Kr, 7Kr và 10Kr tỷ lệ M/P đều tăng hơn so với đối chứng từ 3,6 – 24,7%, còn giống Maybel khi ở liều 5Kr thì tỷ lệ M/P giảm 2,2% nhưng ở liều 7Kr và 10Kr thì tỷ lệ M/P tăng 2,7 – 4,2% so với đối chứng. 75 Đối với cà chua thì độ Brix là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng quả và hàm lượng đường hòa tan. Do các giống cà chua CuBa là giống cà chua có chất lượng cao nên độ Brix luôn đạt từ 4 – 4,5. Thông qua chiếu xạ chúng tôi đã nhận được các dòng cà chua có độ Brix cao hơn hẳn giống gốc từ 4,8 – 5,1. Từ bảng 3.9 ta thấy độ Brix của cả 3 giống Carucha, Delmay và Maybel đều tăng. Giống Delmay và Maybel độ Brix cao khi ở liều chiếu xạ 5Kr và 10Kr, giống Carucha có độ Brix cao khi ở liều chiếu xạ 10Kr. Thông qua các chỉ tiêu về chất lượng có thể kết luận rằng đối với giống Carucha và Maybel dòng cho chất lượng quả cao khi ở liều chiếu xạ 10Kr, với giống Delmay dòng cà chua cho chất lượng cao khi ở liều chiếu xạ 5Kr. 3.6. Đánh giá đa dạng di truyền của các dòng cà chua đột biến ở thế hệ M3 Trong chọn giống cây trồng việc nhận dạng và xác định các đặc điểm của giống cây trồng là rất quan trọng. Thông thường rất khó xác định được sự khác biệt giữa các giống đột biến và các giống nhập nội do đó cần phải có một phương pháp mới để đánh giá các dòng cà chua đột biến. Các phương pháp phân tích đặc điểm di truyền thực vật bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử đã được thực hiện từ những năm 1990. SSR là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài khác nhau, để đánh giá mối quan hệ và sự đa dạng di truyền giữa các giống. Do đó SSR đã được sử dụng trong nghiên cứu này để đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng cà chua đột biến có nguồn gốc từ CuBa. Hơn nữa việc dùng chỉ thị phân tử có thể phân biệt được mức độ sai khác của các dòng đột biến so với giống gốc nhằm xác định bản quyền giống. 76 3.6.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Tách chiết ADN là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Để tách chiết ADN thành công phải lựa chọn phương pháp phù hợp với từng đối tượng. Trong nghiên cứu này chúng tôi dung phương pháp của P.Obaraokeyo &Kako (1998) có một số cải tiến nhỏ. Kết quả tách chiết được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra độ tinh sạch của ADN. 2.6.2. Đánh giá đa dạng di truyền của các dòng cà chua đột biến Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của các dòng cà chua đột biến, chúng tôi sử dụng sản phẩm ADN tách chiết làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 24 cặp mồi. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel polyacrylamide 4,5% và được phát hiện bằng phương pháp nhuộm Ethylrium bromua. Kết quả phân tích 24 mồi SSR trên 12 dòng cà chua đột biến và đối chứng thì có 16 mồi khuếch đại sản phẩn PCR và thu được tổng số 186 băng ADN thuộc 62 loại alen khác nhau. Duy nhất có mồi SSR111 cho locus đơn hình (chỉ thu được 1 alen), 15 cặp mồi còn lại cho các locus đa hình (thu được 3 alen, 4 alen và 5 alen). Trong số 15 mồi cho các locus đa hình có 4 mồi (SSR46, SSR185, SSR578, SSR590) thu được 3 alen, 6 mồi thu được 4 alen (SSR20, SSR38, SSR51, SSR66, SSR80, SSR248) và 5 mồi thu được 5 alen (SSR11, SSR43, SSR96, SSR115, SSR285). Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa hình của các alen ở từng locus SSR. Số liệu của bảng 3.10 cho thấy các dòng cà chua đột biến và đối chứng có nguồn gốc CuBa có hệ số PIC thay đổi từ 0,00 (ở cặp mồi chỉ xuất hiện băng đơn hình- SSR111) đến 0.767 (ở cặp mồi 77 xuất hiện 4 loại alen – SSR20). Hệ số PIC trung bình của 16 mồi nghiên cứu là 0,637. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của tác giả Kwo đã sử dụng 33 mồi SSR được sàng lọc từ 63 giống cà chua, hệ số PIC là 0,628, và cao hơn kết quả nghiên cứu của một số tác giả như Solomom Benor và cộng sự, Pritesh Parmor và cộng sự. Bảng 3.10. Số alen thể hiện và hệ số PIC của 16 mồi SSR STT Tên mồi Vị trí trên NST Số alen xuất Hệ số PIC hiện/mồi 1 SSR11 3 5 0.714 2 SSR20 12 4 0.767 3 SSR38 8 4 0.54 4 SSR43 9 5 0.726 5 SSR46 11 3 0.612 6 SSR51 1 4 0.651 7 SSR66 2 4 0.73 8 SSR80 11 4 0.736 9 SSR96 2 5 0.765 10 SSR111 3 1 0.000 11 SSR115 5 5 0.71 12 SSR135 1 3 0.55 13 SSR248 10 4 0.626 14 SSR285 7 5 0.749 15 SSR578 6 3 0.56 16 SSR590 5 3 0.762 62 10.198 Tổng 78 Trung bình 1 2 3 3.875 4 5 6 7 8 0.637 9 10 11 12 Hình 3.8 . Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi SSR 578 có 10 băng 3 alen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi SSR 66 có 11 băng 4 alen 79 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi SSR 285 có 11 băng 5 alen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi 96 có 11 băng 5 alen 2.6.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các dòng cà chua đột biến Trong số 12 dòng cà chua nghiên cứu với 16 cặp mồi SSR thì tỷ lệ khuyết số liệu của dòng Maybel 7Kr là cao nhất (khuyết 4 trong tổng số 16 cặp mồi xuất hiện băng) chiếm 25%. Giống Carucha đối chứng và Maybel 5Kr khuyết số liệu ở một cặp mồi tương ứng với tỷ lệ 6,25%. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình của giống là 3,13%. Theo Ambionet - CIMMYT, tỷ lệ khuyết số liệu của từng dòng cà chua qua phản ứng PCR không vượt quá 15% thì mới nhận được kết quả đáng tin cậy khi sử dụng phần mềm NTSYSpc để xử lý số liệu. Như vậy, trong 12 dòng cà chua nghiên cứu có 80 11 dòng có ý nghĩa thống kê (M% < 15), trong đó có 9 dòng không bị khuyết số liệu. Bảng 3.11. Tỷ lệ khuyết số liệu(M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các dòng cà chua Kí hiệu Tên giống M(%) H (%) 1 Carucha ĐC 6.25 0.00 2 Carucha 5Kr 0.00 0.00 3 Carucha 7Kr 0.00 0.00 4 Carucha 10Kr 0.00 0.00 5 Delmay ĐC 0.00 0.00 6 Delmay 5Kr 0.00 0.00 7 Delmay 7Kr 0.00 0.00 8 Delmay 10Kr 0.00 0.00 9 Maybel ĐC 0.00 0.00 10 Maybel 5Kr 6.25 0.00 11 Maybel 7Kr 25 0.00 12 Maybel 10Kr 0.00 0.00 3.13 0.00 Trung bình Qua bảng cho thấy 12 dòng cà chua nghiên cứu đều ở trạng thái đồng hợp tử 16 locus trong tổng số 24 locus nghiên cứu. 3.6.4. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các dòng cà chua đột biến 81 Số liệu thu được từ tiêu bản điện di 16 mồi SSR của 12 dòng cà chua chiếu xạ và không chiếu xạ có nguồn gốc từ CuBa và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc2.1 Thiết lập hệ số tương đồng di truyền ( bảng 3.12) và xây dựng sơ đồ phát sinh chủng loại (hình 3.12). Mức độ tương đồng di truyền giữa các cặp giống được thể hiện thông qua hệ số tương đồng di truyền hay chỉ số tương đồng di truyền. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống được tính từ 0 đến 1. Qua kết quả thu được ở hình và bảng cho thấy, hệ số tương đồng di truyền của 12 dòng cà chua chiếu xạ và không chiếu xạ dao động trong khoảng 0,03- 0,72. 82 Hình.3.12. Sơ đồ phát sinh chủng loại Bảng 3.12. Hệ số tương đồng di truyền của các dòng cà chua 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1.00 2 0.72 1.00 3 0.41 0.52 1.00 4 0.15 0.19 0.45 1.00 5 0.15 0.14 0.28 0.52 1.00 6 0.11 0.10 0.14 0.19 0.39 1.00 7 0.15 0.14 0.23 0.10 0.19 0.39 1.00 8 0.11 0.10 0.14 0.14 0.14 0.33 0.52 1.00 9 0.11 0.10 0.14 0.10 0.19 0.33 0.45 0.68 1.00 10 0.07 0.11 0.07 0.03 0.03 0.15 0.11 0.24 0.29 1.00 11 0.08 0.17 0.12 0.04 0.04 0.12 0.08 0.17 0.17 0.35 1.00 12 0.07 0.10 0.07 0.03 0.07 0.10 0.10 0.23 0.23 0.35 0.40 83 12 1.00 Từ sơ đồ phát sinh chủng loại, xét ở hệ số tương đồng di truyền 0,29 các dòng cà chua được chia thành 4 nhóm như sau: Nhóm I gồm 3 dòng: Carucha ĐC, Carucha 5Kr, Carucha 7Kr, có hệ số tương đồng di truyền là 0,45 Nhóm II gồm 2 dòng: Carucha 10Kr, Delmay ĐC có hệ số tương đồng di truyền là 0,82. Nhóm III có 4 dòng Delmay 5 Kr, Delmay 7Kr, Delmay 10Kr và Maybel ĐC, hệ số tương đồng của nhóm là 0,35, nhóm III được chia thành 2 nhóm phụ: - Nhóm III.1: Chỉ có 1 dòng là Delmay 5 Kr. - Nhóm III.2: Có 3 dòng Delmay 7Kr, Delmay 10Kr và Maybel ĐC Nhóm IV: Gồm 3 dòng Maybel 5Kr, Maybel 7Kr, Maybel 10Kr, hệ số tương đồng của nhóm là 0,33. Nhóm này được chia thành 2 nhóm phụ: - Nhóm IV.1: Chỉ có 1 dòng Maybel 5Kr. - Nhóm IV.2: Gồm 2 dòng Maybel 7Kr và Maybel 10Kr, có hệ số tương đồng di truyền là 0,4. Từ kết quả thống kê cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các dòng cà chua phân bố nhiều nhất trong khoảng 0,29 – 0,55, có 10 cặp mẫu chiếm 62,5%. Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ số tương đồng của các dòng cà chua đột biến có nguồn gốc từ CuBa thấp hơn các giống cà chua khác như cà chua Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Mỹ hệ số tương đồng di truyền là 0,85 ( Solomon Benor và cs, 2008), thấp hơn nghiên cứu của tác giả Kwo (0,644) nhưng kết quả cao hơn nghiên cứu của tác giả Nunome et al (2000). 84 KẾT LUẬN...