Nội dung

  VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ TẤT THÀNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2016        VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… LÊ TẤT THÀNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62 44 01 17 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Quốc Long 2. TSKH. Andrey B. Imbs. Hà Nội – 2016     MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................................... iv LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................................v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ ...................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG................................................................................................................. xi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN......................................................................................................4 1.1. Lipit và axit béo ..................................................................................................................4 1.1.1. Lipit .......................................................................................................... 4 1.1.2. Các axit béo ............................................................................................. 6 1.1.3. Lipit và axit béo của rong Đỏ ................................................................ 11 1.2. Phương pháp nhận dạng, phân lập lipit và axit béo ...................................................... 12 1.2.1. Phương pháp nhận dạng lipit ................................................................ 12 1.2.2. Phương pháp phân lập lipit từ sinh vật biển ......................................... 13 1.2.3. Phương pháp phân lập và nhận dạng axit béo ...................................... 15 1.3. Hoạt chất sinh học biển ................................................................................................... 15 1.4. Hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm axit béo C20 đa nối đôi – axit arachidonic 18 1.4.1. Nhóm axit béo C20 đa nối đôi ............................................................... 18 1.4.2. Axit arachidonic ..................................................................................... 19 1.4.3. Hoạt tính sinh học của axit arachidonic ................................................ 20 1.5. Hoạt chất prostaglandin: hoá học và hoạt tính sinh học ............................................... 23 1.5.1. Hoá học hoạt chất prostaglandin .......................................................... 23 1.5.2. Sinh tổng hợp prostaglandin .................................................................. 25 1.5.3. Sàng lọc các prostaglandin E từ nguyên liệu tự nhiên .......................... 27 1.5.4. Tác dụng sinh lí của prostaglandin ....................................................... 27 1.6. Tổng quan về rong biển .................................................................................................. 33 1.6.1. Giới thiệu chung.................................................................................................... 33 1.6.2. Những nghiên cứu về rong biển ở Việt Nam ...................................................... 35   i   2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48 2.2.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu ....................................................... 48 2.2.2. Phương pháp phân lập, tách chiết lipit, axit béo, axit arachidonic, prostaglandin ................................................................................................... 49 2.2.3. Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng và cấu trúc hoá học của các axit béo và prostaglandin .......................................................................... 50 2.2.4. Phương pháp phân tích cấu tử chính và phân tích chùm ...................... 51 2.3. Các dung môi, hoá chất sử dụng .................................................................................... 51 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 52 3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipit tổng ................................................................. 52 3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axít béo .......................................................... 53 3.3. Sàng lọc định tính, định lượng prostaglandin ............................................................... 53 3.3.1. Phân tích định tính prostaglandin ......................................................... 53 3.3.2. Phân tích định lượng PGE2 trong các mẫu rong Đỏ ............................. 54 3.3.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng prostaglandin và axit béo trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................. 54 3.4. Phân lập prostaglandin từ rong Đỏ ................................................................................ 55 3.4.1. Phân lập PGE2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla .............. 55 3.4.2. Nhận biết PGE3 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla ............ 57 3.5. Phân lập, tinh chế thu nhận axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria tenuistipitata .......................................................................................................................... 57 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 60 4.1. Nghiên cứu sàng lọc lipit và axit béo của rong Đỏ....................................................... 60 4.1.1. Khảo sát hàm lượng lipit tổng ............................................................... 60 4.1.2. Khảo sát thành phần và hàm lượng các axit béo ................................... 63 4.1.2.1. Thành phần và hàm lượng axit béo của các loài thuộc họ rong Câu Gracilariaceae ...................................................................................... 62   ii   4.1.2.2. Thành phần và hàm lượng axit béo của các loài thuộc chi Hypnea họ rong Đông ................................................................................. 67 4.1.2.3. Thành phần và hàm lượng axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ còn lại .......................................................................................................... 71 4.1.2.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích luỹ lipit và hình thành các axit béo của rong Đỏ .................................................................. 74 4.1.3. Sử dụng phương pháp phân tích thành phần chính và phương pháp phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo của các mẫu rong Đỏ..................................................................................................................... 79 4.2. Nghiên cứu phát hiện prostaglandin từ các loài rong Đỏ............................................. 83 4.2.1. Sàng lọc PGE2 từ các loài rong Đỏ ....................................................... 83 4.2.2. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo, prostaglandin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla của Nga nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam .......................................................................................................... 88 4.3. Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ ................................................................ 93 4.3.1. Phân lập prostaglandin E2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla94 4.3.2. Nhận biết PGE3 ở loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla ............ 104 4.3.3. Bàn luận về sự chuyển hoá của axit béo họ eicosanoit thành các prostaglandin bằng enzyme nội sinh từ rong Đỏ ........................................... 106 4.4. Phân lập và xác đinh cấu trúc axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria tenuistipitata ........................................................................................................................ 108 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 117 KẾT LUẬN ............................................................................................................................. 117 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................................... 120 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................... 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 123       iii   LỜI CAM ĐOAN   Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Quốc Long và TSKH. Andrey B. Imbs (Liên Bang Nga). Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả Lê Tất Thành   iv   LỜI CẢM ƠN   Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS Phạm Quốc Long và TSKH Andrey B. Imbs, những người thầy bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi nghiên cứu luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị em đồng nghiệp Phòng Hoá sinh hữu cơ, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên, Phòng Phân tích hoá học – Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (VAST) đã giúp đỡ tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, các kiến thức thực nghiệm… để tôi hoàn thành tốt công trình nghiên cứu của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp Viện Sinh vật biển, Phân viện Viễn Đông – Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành tốt công trình nghiên cứu khoa học này. Tác giả Lê Tất Thành   v   DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt A.O.A.C Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích RNA Ribonucleic acid Phân tử ARN Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 COX Cyclooxygenase Enzyme Cyclo-oxygen CPEFA Cyclopropenoic acid Axit cyclopropenoic DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ED50 Effective dose 50% Essential polyunsaturated fatty acids No essential polyunsaturated fatty acids Liều gây chết hiệu quả Axit béo mạch dài không no thiết yếu 13 C-NMR E- PUFA NE- PUFA Axit béo không thiết yếu Thụ thể nhóm E của prostaglandin Axit béo EP Eprostanoid FA Fatty acid FFA Free fatty acid Gas chromatography Mass spectrometry Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Axit béo tự do Phổ tương quan 1H-13C xa n-3 n-6 PCA Heteronuclear Multiple Bond Connectivity High performance liquid chromatography High polyunsaturated fatty acid n-3 fatty acid n-6 fatty acid Principal Component Analysic PC Principal Component Cấu tử chính PG Prostaglandin Prostaglandin GS-MS 1 H-NMR HMBC HPLC HUFA   vi   Sắc kí khí khối phổ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton. Sắc kí lỏng cao áp Axit béo đa nối đôi cao Axit béo có nối đôi ở vị trí n-3 Axit béo có nối đôi ở vị trí n-6 Phân tích cấu tử chính PGE2 Prostaglandin E2 Prostaglandin E2 PGE3 Prostaglandin E3 Prostaglandin E3 PGI2 Prostaglandin I2 Prostaglandin I2 PGH2 POL PUFA TG TXA2 VLDL Prostaglandin H2 Lipit Peroxidation Polyunsaturated fatty acids Triglyceride Thromboxan A2 Very-low-density lipoprotein Prostaglandin H2 Peroxy hoá lipit Các axit béo đa nối đôi Triglyxerit Thromboxan A2 Lipoprotein mật độ rất thấp       vii   DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lipit ............................................................................. 4 Hình 1.2. Cấu tạo lipit trên cơ sở glyxerin ........................................................... 5 Hình 1.3. Cấu tạo lipit trên cơ sở sphingozin ....................................................... 5 Hình 1.4. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-3 ....................................... 9 Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-6 ...................................... 10 Hình 1.6. Sắc kí bản mỏng (TLC) điều chế các lớp chất lipit .............................. 13 Hình 1.7. Công thức cấu tạo và sự chuyển hoá của một số dẫn xuất prostaglandin ...................................................................................................... 24 Hình 1.8. Sinh tổng hợp các PG2 từ axit arachidonic (AA) .................................. 26 Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu .............................................................................. 40 Hình 2.2. Ảnh 25 loài rong Đỏ đại diện cho 69 mẫu nghiên cứu ......................... 45 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu chung ....................................................................... 52 Hình 4.1. Kết quả phân tích PCA của các mẫu rong Đỏ ...................................... 82 Hình 4.2. Biểu đồ phân loại hình cây của 69 mẫu rong Đỏ dựa vào thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu ........................................................................ 83 Hình 4.3. Phân tích định tính PGE2 bằng sắc kí lớp mỏng ................................... 84 Hình 4.4. Sắc kí lớp mỏng định tính PGE2 có trong mẫu rong Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf. nuôi trong PTN ................................................ 92 Hình 4.5. Sơ đồ phân lập prostaglandin từ rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf. ..................................................................................................... 94 Hình 4.6. Xác định PGE2 trong dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau ..... 95 Hình 4.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất PGE2 .................................................... 99 Hình 4.8. Tương tác H-H COSY (nét đậm) và H-C HMBC (mũi tên) của hợp chất PGE2 ..................................................................................................................... 99 Hình 4.9. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất PGE2 ........................................ 100 Hình 4.10. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 ....... 100 Hình 4.11. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 ...... 101 Hình 4.12. Phổ DEPT NMR (125 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 . 101   viii