Nội dung

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2019 Tác giả luận án Lê Quốc Việt ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân và PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn tác giả Hoàng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo và Bùi Trần Anh Đào đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Quốc Việt iii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... ii Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii Mục lục ............................................................................................................................. iv Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vii Danh mục bảng ............................................................................................................... viii Danh mục hình .................................................................................................................. ix Trích yếu luận án .............................................................................................................. xi Thesis abstract................................................................................................................. xiii Phần 1. Mở đầu ................................................................................................................ 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .............................................................................. 3 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................. 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................... 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................................... 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 4 2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu ............................................................................ 4 2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên thế giới ................................................................................................................... 4 2.2. Một số đặc tính của liên cầu khuẩn lợn ................................................................. 7 2.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................. 8 2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa ................................................................................ 9 2.2.3. Sức đề kháng ........................................................................................................ 10 2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................................................ 11 2.2.5. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 13 2.3. Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do vi khuẩn S. Suis gây ra ........................... 14 2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn .................................. 14 2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người .............................. 16 2.4. Chẩn đoán ............................................................................................................ 17 iv 2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR ..................................................................... 18 2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA ................................................................. 19 2.5. Điều trị ................................................................................................................ 19 2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh ............................................................................ 19 2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh ............................................................................ 20 2.6. Giới thiệu về hạt nano vàng và kỹ thuật sắc ký miễn dịch .................................. 20 2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng ................................................................................ 20 2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch.................................................................................... 20 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................. 26 3.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 26 3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................ 26 3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 ..................... 26 3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2 ........... 27 3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2 ............ 27 3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ............................................................................................................ 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 27 3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 .................. 27 3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2 ............................ 33 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 37 3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 38 3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................................. 40 Phần 4. Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 41 4.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 2 ........................... 41 4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ ................................... 41 4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 ....... 44 4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2 .......................................... 55 4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S. Suis type 2 ................ 57 4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên .................................... 57 v 4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp ứng miễn dịch ở chuột SA .......................................................................................... 60 4.2.3. Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả năng sinh miễn dịch của chuột SA .............................................................................................................. 63 4.2.4. Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2 ................ 66 4.2.5. Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế ............................................................ 71 4.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S. Suis type 2 ........... 72 4.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano ............................................................................................................. 72 4.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng S. suis type 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano ...................................................................................................................... 74 4.3.3. Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp .................................................................... 77 4.4. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ..................................................................................... 79 4.4.1. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp............................... 79 4.4.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT .............................................. 81 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ....................................................................................... 87 5.1. Kết luận ................................................................................................................ 87 5.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 88 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án ........................................... 89 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 90 Phụ lục ........................................................................................................................... 103 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải 6PGD : 6-phosphogluconate-dehydrogenase ADN : Acid deoxyribo nucleic ARN : Axit ribonucleic Bp : Base pair dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate E. coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay/ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ICT : Immunochromatographic test/ Kỹ thuật sắc ký miễn dịch IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobase kDa : Kilodalton NC : Nitrocellulose PBS : Phosphat Buffer Saline PCR : Polymerase Chain Reaction/ phản ứng khuếch đại gene S. suis : Streptococcus suis SDS : Sodium dodecyl sulfate X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto- pyranoside vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1. Thành phần phản ứng PCR phát hiện S. suis type 2 .......................................... 29 3.2. Chu trình nhiệt cho PCR phát hiện mẫu dương tính .......................................... 29 3.3. Thành phần PCR nhân đoạn gene 6PGD ........................................................... 30 3.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gene 6PGD ................................................ 31 3.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tạo dòng ......................... 31 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch ............................................................................................................ 34 3.7. Bố trí thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch .............. 34 3.8. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh ............................. 39 4.1. Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 ở lợn tại một số lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế ........................................................................................................... 42 4.2. Kết quả sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2 ....................................................... 50 4.3. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng TTHSS2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng SC 19 trên ngân hàng gene ...................................................................................................54 4.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên .......................... 58 4.5. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA ............................................................................................................. 61 4.6. Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA..................... 64 4.7. Kết quả chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 ................................................. 67 4.8. Kết quả phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 ở các nồng độ kháng thể bắt khác nhau ........................................................................................................... 81 4.9. Ngưỡng phát hiện của KIT phát hiện nhanh vi khuẩn S. suis type 2 ................... 83 4.10. Đánh giá độ đặc hiệu của KIT ........................................................................... 85 4.11. Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT ............................................ 86 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis.................................................................. 8 2.2. Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh ............................................................................ 22 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh ....................................................... 24 3.1. Cấu trúc vector pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega) .............................. 32 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2 .................................... 42 4.2. Kết quả phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis trên môi trường thạch máu cừu 5% ................................................................................................................. 44 4.3. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc ......................... 45 4.4. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn ...................... 46 4.5. Kết quả kiểm tra Streptococcus spp trên môi trường Bile Esculin agar .............. 47 4.6. Kết quả lên men đường glucose và lactose của vi khuẩn S. suis ......................... 48 4.7. Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn ......................................................... 48 4.8. Kiểm tra khả năng sinh indol của vi khuẩn S. suis............................................... 49 4.9. Kết quả PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 ................................................. 50 4.10. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2 ..................................... 51 4.11. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli Top 10 ............... 52 4.12. Kết quả PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng và kết quả các khuẩn lạc trắng PCR cùng cặp mồi M13 ............................................................. 53 4.13. So sánh mức độ tương đồng của amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD của chủng TTHSS2 và đoạn gene đã được công bố WP_012028448.1 .............. 54 4.14. Kết quả cấy vi khuẩn TTHSS2 bất hoạt cấy trên môi trường thạch máu cừu 5% ................................................................................................................. 56 4.15. Kết quả đánh giá tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2 ................................. 59 4.16. So sánh đáp ứng chuột khi được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 với các liều khác nhau ...................................................................................................... 62 4.17. Đáp ứng miễn dịch của chuột được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 phối trộn với các chất bổ trợ khác nhau ....................................................................... 65 4.18. Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng thể đã tinh sạch ............................................................................................................... 68 ix