Nội dung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y H N I, NĂM 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I NGUYỄN TÙNG NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 62.64.01.04 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN BÁ HIÊN TS NGUYỄN VĂN CẢM H N I, NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều được cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án đều chính xác và được nêu rõ nguồn gốc. Hà nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn đoán Thú y đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Nguyễn Văn Cảm – Hội Thú y , là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại các tổ chức và cơ quan quốc tế như FAO, CDC, USDA đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu và luận án. Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Tùng ii M CL C Lời cảm ơn Lời cam đoan cl c Danh m c các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh m c các bảng Danh m c các hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.1.1. Lịch sử bệnh trên thế giới 1.1.2. Bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.2. Nguyên nhân của bệnh cúm gia cầm 1.2.1. Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm 1.2.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm 1.2.3. Đặc điểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm giai đoạn 1996-2008 1.2.4. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 1.2.6. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm 1.2.7. Triệu chứng lâm sàng của gia cầm mắc bệnh cúm 1.2.8. Bệnh tích của gia cầm mắc cúm gia cầm 1.3. Chẩn đoán bệnh 1.3.1. Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học 1.3.2. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích 1.3.3. Chẩn đoán phòng thí nghiệm 1.4. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 1.4.1. Tình hình sử d ng vắc-xin cúm gia cầm trên thế giới 1.4.2. Tình hình sử s ng vắc-xin cúm gia cầm tại Việt Nam 1.5. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm Việt Nam CHƯƠNG 2. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung 2.1.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm A H N1 từ các mẫu dịch ngoáy ổ nhớp 2.1.2. Xác định đặc tính di truyền học của virus cúm A/H5N1 clade 7 2.1.3. Xác định một số đặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7 2.1.4. Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên) 2.1.5. Xác định hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1 2.2. Địa điểm nghiên cứu 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu Trang i ii iii v vi viii 1 4 4 4 7 9 10 14 20 29 30 32 34 36 36 36 36 37 37 39 41 42 44 46 46 46 46 46 46 46 47 47 47 iii CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm H5N1 clade 7 3.2. Xác định đặc tính di truyền của virus cúm A H N1 thuộc clade phân lập Việt Nam 3.2.1. Giải trình tự gen HA (H ) và phân tích cây phả hệ sử d ng chuỗi gen H5 3.2.2. Giải trình tự gen NA(N1) và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi nucleotide của gen N1 3.2.3. Giải trình tự gen và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi nucleotide của gen M 3.3. Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus A/H5N1 clade 7 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà (xác định chỉ số EID50) 3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (xác định chỉ số TCID50) 3.3.3. Kết quả xác định độc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 3.3.4. Kết quả đánh giá độ bài thải virus trên động vật thí nghiệm 3.3.5. Đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng của virus cúm A/H5N1clade 7 3.3.6. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam. 3.3.7. Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Re-1 đối với virus cúm A H N1HA clade trên gà. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tài liệu tham khảo Công trình công bố liên quan đến luận án Ph l c 59 59 62 62 71 78 84 84 89 92 103 106 113 116 121 124 135 136 iv DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CH VIẾT T T Viết tắt Tên đầy đủ AI CDC CEF CK cs Ct DEF Dk EID50 ELD50 FAO HA HI HPAI IHC LPAI M MDCK MDEF MDT MEGA NA NCBI NCVD NP NS OIE PA PB1 PB2 RNA RRT-PCR TCID50 WHO Avian Influenza Center of Disease Control and Prevention Chicken Embryo Fibroblast Chicken cộng sự Cycle Threshold Duck Embryo Fibroblast Duck Embryo Infection Dose 50% Embryo Lethal Dose 50% Food and Agriculture Organisation Hemaglutinin Hemagglutination Inhibition Highly Pathogenic Avian Influenza Immuno Histochemistry Low Pathogenic Avian Influenza Matrix protein Mardine Darby Canine Kidney Muscovy Duck Embryo Fibroblast Mean Death Time Molecular Evolution Genetic Analysis Neuraminidase National Center for Biotechonology Information National Centre for Veterinary Diagnostics Nucleoprotein Non-strutural protein Office International des Epizooties Polymerase acidic Polymerase basic protein 1 Polymerase basic protein 2 Ribonucleic acid Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction Tissue Culture Infection Dose 50% World Health Organisation v DANH M C CÁC BẢNG TT 1.1. 1.2. 1.3 1.4 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. 3.12. 3.13. 3.14. 3.15. 3.16. 3.17. Tên bảng Trang Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A H N1 người báo cáo 6 cho WHO đến 4 2012 ột số đặc điểm triệu chứng của gia cầm mắc cúm A/H5N1 34 Một số loại vacxin phòng cúm gia cầm H N1 đang được sử d ng 40 trên thế giới Kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm chương trình quốc gia 41 Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp eed-Muench 49 Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 52 Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng cho ealtime T-PCR 52 Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng) T-PC giải trình tự gen 55 Trình tự primer để giải trình tự gen(theo quy trình CDC) 56 Kết quả xét nghiệm virus từ chương trình giám sát biên giới 60 Kết quả giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài các mẫu 62 virus cúm A H N1 phát hiện Lạng Sơn Danh sách các chủng virus cúm A H N1 dùng để so sánh và lập cây 66 phát sinh loài dựa trên gen H5 So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen HA của chủng 69 virus A H N1 clade với một số chủng tham chiếu Danh sách các chủng virus A H N1 sử d ng để so sánh và lập cây 74 phát sinh loài dựa trên N1 So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng 77 virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu Danh sách các chủng virus cúm A H N1 sử d ng để so sánh và lập 80 cây phát sinh loài dựa trên gen So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen của 5 chủng virus 83 cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu Theo dõi thời gian gây chết phôi 85 Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus 86 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Theo dõi thời gian virus gây nhiễm lên tế bào CEF 89 Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus 90 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 93 Các axit amin vùng “cleavage site” của virus cúm H N1 độc lực cao clade và một số chủng virus tham chiếu Kết quả đánh giá độc lực của virus cúm A/H5N1clade trên gia 95 cầm Kết quả theo dõi lâm sàng của gà thí nghiệm 96 Đánh giá độ bài thải virus khi gây nhiễm b ng virus A/chicken/ 103 Vietnam/NCVD-016/2008 Kết quả xét nghiệm T-PC đối với một số loại phủ tạng gà gây 107 bệnh b ng virus A H N1 clade và chuyển đổi sang nồng độ virus vi 3.18. 3.19. 3.20. Phân bố bệnh tích vi thể và nhuộm IHC phát hiện kháng nguyên virus cúm H N1A chicken Vietnam NCVD-016/2008 Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 clade phân lập được b ng phản ứng HI Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường độc gà tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 Re-1 109 115 118 vii DANH M C CÁC H NH TT 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10. 1.11. 1.12. 1.13. 1.14. 1.15. 1.16. 2.1. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. Tên hình Trang Bản đồ phân bố các ca cúm A/H5N1trên thế giới (tính đến 2009) 5 Biểu đồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo thời 8 gian (A) ô phỏng hình thái của virus cúm, (B) Hình thái kính hiển vi 10 điện tử ô hình hệ gen virus cúm A 14 ô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neurminidase 15 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của các phân đoạn genvirus cúm A 20 Sơ đồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm 20 A/H5N1và H3N2 Cây phả hệ dựa trên gen HA các virus cúm A H N1 độc lực cao 22 Sự tiến hóa của các clade virus A/H5N1 theo thời gian 23 Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 200324 2009 Thời gian xuất hiện của các clade H5N1 Việt Nam từ 2001-2007 25 Hình 1.12. Sự phân bố các clade virus A/H5N1 khác nhau theo 27 không gian Các genotype của virus cúm gia cầm A H N1 độc lực cao 28 ối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 30 ô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A tế bào chủ 31 Minh hoạ vùng “Cleavage site” của virus cúm độc lực thấp(LPAI) 33 Sơ đồ bố trí primer giải trình tự gen H , N1 và virus cúm A H N1 52 Hình 3.1. Bản đồ nơi phát hiện được virus A/H5N1 clade 7 61 Cây phả hệ dựa trên gen H5 của các virus A H N1 clade 7 62 Hiện tượng chèn và xóa các axit amin tại vị trí cleavage site của các 71 chủng virus A H N1 clade phân lập Việt Nam Cây phả hệ dựa trên gen N1 các virus A H N1 clade 73 Cây phả hệ dựa trên gen các virus A H N1 clade 79 Kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA) 87 Kết quả kiểm tra bệnh tích phôi bsau khi gây nhiễm b ng chủng virus 88 cúm A H N1 clade phân lập tại Việt Nam Hình ảnh tế bào CEF và DEF khi phân lập và chuẩn độ virus 92 Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng virus A/H5N1 98 Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016) ôt số hình ảnh thể hiện bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng 99 virus A H N1 clade 2.3.4 và 2.3.2 viii