Nội dung

Lời Cảm Ơn Những lời đầu tiên trong bản khóa luận này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn đề tài khóa luận của tôi, cô PSG.TS. Nguyễn Thị Thu Lan. Cảm ơn cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy ThS. Lê Trung Hiếuđã chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong khoa Hóa, bộ môn Hóa Hữu cơ, phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tận tình giúp đỡvà tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Trần Trâm Anh học viên Cao học K22, cùng các học anh chị học viên Cao học K21,22, các bạn trong tập thể Lớp Hóa K35, đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Một lần nữa xin được cảm ơn gia đình, thầy, cô và bạn bè đã đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh viên. Huế, ngày 27 tháng 05 năm 2015. Ngô Thu Trang i i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮTvi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí và đặc điểm thực vật 2 1.2. Phân bố 3 1.3. Vài nét về họ gì?.........................................................................................................3 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đốitượng nghiên cứu và dụng cụ, thiết bị, hóa chất 15 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu............................................................................................15 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất....................................................................................15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Phương pháp thu hái và xử lý mẫu......................................................................16 2.3.3. Phương pháp chiết rắn – lỏng và chiết lỏng–lỏng để tách các cao.....................18 2.3.4. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong cao tổng và các cao phân đoạn.......................................................................................................................20 2.3.5. Sắc ký bản mỏng và sắc ký cột..............................................................................21 2.3.6. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần hóa học của các cao chiết...............................................................................................25 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Thu hái, định danh và xử lý mẫu 26 3.1.1. Thu hái.................................................................................................................. 26 3.1.2. Mô tả và định danh...............................................................................................26 3.1.3. Xử lí mẫu...............................................................................................................27 3.2. Độ ẩm của lá cây Bằng lăng nước 27 ii 3.3. Độ tro của lá cây Bằng lăng nước 27 3.4. Chiết phân đoạn các hợp chất từ lá cây Bằng lăng nước 3.5. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên 28 29 3.5.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên từ cao ethanol tách chiết được 29 3.5.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên từ các cao chiết phân đoạn nhexane, ethyl acetate, n-butanol.....................................................................................30 3.6. Định danh các hợp chất dễ bay hơi trong cao n-hexane, ethyl acetate và nbutanol bằng GC-MS 35 3.6.1. Định danh một số hợp chất trong cao n-hexane bằng GC-MS...........................35 3.6.2. Định danh một số hợp chất trong cao ethyl acetate bằng GC-MS......................36 3.6.3. Định danh một số hợp chất trong cao n-butanol bằng GC – MS........................37 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT VAD UTI GC-MS SKBM SKC Acid valoneic dilactone Urinary Tract Infection Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký bản mỏng Sắc ký cột iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại khoa học (Scientific classification)....................................................2 Bảng 1.2. Phân loại flavonoid............................................................................................7 Bảng 3.1. Độ ẩm trung bình của mẫu lá cây Bằng lăng nước..........................................27 Bảng 3.2. Độ tro của mẫu lá cây Bằng lăng nước............................................................28 Bảng 3.3. Khối lượng cao tổng và các cao phân đoạn.....................................................29 Bảng 3.3. Kết quả định tính các nhóm chức hữu cơ thiên nhiên từ cao ethanol...............29 Bảng 3.5. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao chiết phân đoạn................34 Bảng 3.6. Các hợp chất được định danh trong cao n-hexane lá cây Bằng lăng nước.......35 Bảng 3.7. Các hợp chất được định danh trong cao ethyl acetate lá cây Bằng lăng nước..36 Bảng 3.8. Các hợp chất được định danh trong cao n-butanol lá cây Bằng Lăng nước.....37 Bảng 3.9. Kết quả SKBM cao ethyl acetate với các hệ dung môi khảo sát tương ứng.....39 Bảng 3.10. Kết quả SKBM các phân đoạn trong cao ethyl acetate..................................43 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Các amino acid trong lá cây Bằng lăng nước Hình 1.2. Stigmast-4-en-3,6-diol đã được phân lập từ loài Lagerstroemia lancateri Hình 1.3. Một số alkaloid đã được phân lập từ loài Lagerstroemia indica Linn. Hình 1.4. Một số alkaloid có trong lá của loài Lagerstroemia subcostata Hình 1.5. Một số alkaloid đã được phân lập từ loài Lagerstroemia fauriei Hình 1.6. Một số tannin có trong lá và vỏ cây Bằng lăng nước Hình 1.7. Một số chất đã được phân lập từ lá cây Bằng lăng nước Hình 1.8. Acid corosolic Hình 2.1. Lá, cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa)...........................................14 Hình 2.2. Sơ đồ chiết rắn – lỏng và lỏng – lỏng lá cây Bằng lăng nước...........................18 Hình 3.1. Lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) dùng làm nguyên liệu........25 Hình 3.2. Hình ảnh định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong các cao phân đoạn..........32 Hình 3.3. Sắc ký đồ của cao ethyl acetate với các hệ dung môi khác nhau......................39 Hình 3.4. Sơ đồ cắt lớp từ cao ethyl acetate.....................................................................39 Hình 3.5. Sắc ký đồ của 5 phân đoạn ứng với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate = 2/1.................................................................................................................................... 41 vi MỞ ĐẦU Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa, do dó có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Nhiều loài thực vật trở thành thực phẩm và các vị thuốc quý hiếm cho y học cổ truyền và cả y học hiện đại. Một trong những dược liệu quý chưa được nghiên cứu nhiều là cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa). Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh tiểu đường của các thành phần có trong cây Bằng lăng nước như các công trình ở Mỹ, Philippines [31], [34], công trình của Kakura, Garcia và một nhóm các nhà khoa học thuộc trường đại học Hirosima, Nhật Bản [16], [20]. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này. Qua các kết quả tìm hiểu thu được ở trên, chúng tôi thấy rằng cây Bằng lăng nước là một loại dược liệu quý mà ở Việt Nam chưa được quan tâm nhiều, do đó việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bằng lăng nước để tìm hiểu hợp chất tạo nên hoạt tính của loài cây này, nhằm nâng cao hơn nữa giá trị sử dụng là một việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Vì vậy, trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập một cấu tử từ lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) thu hái tại Thừa Thiên Huế”. 1 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Vị trí và đặc điểm thực vật [27], [36] Họ Bằng lăng (hay Tử vi, Tường vi) có tên khoa học là Lythraceae, bao gồm khoảng trên 500 loài thuộc 32 chi, chủ yếu là cây thân thảo với một ít loài là cây thân bụi hoặc cây thân gỗ. Các thực vật họ Lythraceae phân bố khắp toàn cầu. Phần lớn các loài ở vùng nhiệt đới, tuy nhiên chúng cũng sống tốt trong các khu vực có khí hậu ôn đới [9]. Bảng 1.1. Phân loại khoa học (Scientific classification) Bộ (ordo) Đào kim nương (Myrtales) Họ (familia) Bằng lăng (Lythraceae) Chi (genus) Tử vi (Lagerstroemia) Loài (specie) Lagerstroemia speciosa Bằng lăng nước có tên khoa học là Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., là một trong số 50 loài thuộc chi Tử vi (Lagerstroemia). Nó là loại cây gỗ lớn cao với thân cây thẳng và khá nhẵn nhụi, phân cành cao, tán dày. Lá cây có màu xanh lục, dài từ 8 đến 15cm, rộng từ 3 đến 7cm, hình oval hoặc elip, rụng theo mùa. Hoa màu tím hoặc tím nhạt, mọc thành chùm dài từ 20 đến 40 cm, thường thấy vào giữa mùa hè. Cụm hoa hình tháp ở ngọn các cành, mọc thẳng. Nụ hoa hình cầu, hoa lớn có 6 cánh, mỗi cánh dài chừng 2 đến 3,5cm, có móng ngắn, trên cánh có những ngấn nhăn nhỏ. Bằng lăng nước ra hoa vào giữa mùa hè, thường nở rộ vào khoảng tháng 6. Quả hình trứng, mọc thành chùm, kích thước 20x18mm, mở theo 6 mảnh. Khi tươi quả có màu xanh nhạt, khi chín quả màu đen rồi bung ra để phát tán hạt [9]. 1.2. Phân bố Ở Việt Nam, cây được gọi đơn giản là Bằng lăng, mọc rất nhiều ở khu vực miền Bắc Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Trên thế giới phân bố ở các nước vùng 2 Nam và Đông Nam Á như: Myanma, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Philippines. Ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ và Australia cũng gặp loài này [5]. 1.3. Vài nét về họ Lythraceae là danh pháp khoa học của một họ thực vật có hoa. Nó bao gồm khoảng 500-620 loài, chủ yếu là cây thân thảo, với một ít loài là cây bụi hoặc cây thân gỗ, trong 32 chi. Trong Tiếng Việt nó được gọi là họ Trân châu (theo chi Lythrum) hoặc họ Tử vi (theo chi Lagerstroemia). Họ Lythraceae phân bổ khắp toàn cầu, với phần lớn các loài ở vùng nhiệt đới nhưng chúng cũng sinh sống tốt trong các khu vực có khí hậu ôn đới. Chi Lythraceae từ đó có danh pháp là chi Lythrum, chứa các loài Trân châu (chẳng hạn Lythrum salicaria Trân châu tía). Hiện nay người ta đã gộp cả lựu, trước đây được xếp trong một họ riêng là Punicacea [2]. 1.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Bằng lăng 1.4.1. Nghiên cứu ở nước ngoài [9] Các thực vật thuộc chi Lagerstroemia phân bố rộng và có nhiều loài được dùng trong Y học. Do vậy, đã có nhiều công trình nghiên cứu về chúng và chỉ ra rằng, đây là một chi thực vật chứa nhiều tannin và alkaloid. Theo dõi trên Chemical Abstract cho đến năm 1999 (thế các năm về sau đến nay thì sao?) cho thấy: Phần lớn các công trình nghiên cứu về cây Bằng lăng nước tập trung vào các hướng sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây. - Nghiên cứu công dụng của một số hợp chất có trong lá để chữa bệnh. Năm 1961, Carew D.P. và Chin T.F. đã làm các thí nghiệm để kiểm tra một số nhóm chất có trong lá Bằng lăng nước ở Philippines và đã đi đến kết luận: trong lá có tannin, glucoside [28]. Kết quả các nghiên cứu khác cho thấy, thành phần hóa học của chi Lagerstroemia bao gồm: acid béo và dẫn xuất, các terpenoid, các alkaloid và tannin, v.v a. Acid và dẫn xuất Năm 1991, công trình nghiên cứu của Daulatabad C.D và các cộng sự đã xác định được các acid có trong dầu lấy từ hạt loài Lagerstroemia thomsonii [14]. 3 1. Acid panmitic: CH3(CH2)16COOH 2. Acid oleic: CH3(CH2)14COOH 3. Acid stearic: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7 COOH 4. Acid linoleic: CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Một nghiên cứu khác cho thấy, trong lá cây Bằng lăng nước có các amino acid như isoleucin, alanin, acid -aminobutyric và methionin [28]. Isoleucin Acidaminobutyric Alanin Methionin Hình 1.1. Các amino acid trong lá cây Bằng lăng nước b. Terpenoid Người ta cũng đã phân lập được một số terpenoid từ loài Lagerstroemia lancateri như stigmast-4-en-3,6-diol, lagerstronolide [21], lagerenol, lagerenyl acetate [26]. Còn từ loài Lagerstroemia parviflora đã phân lập được lagerflorin [12]. Hình 1.2. Stigmast-4-en-3,6-diol đã được phân lập từ loài Lagerstroemia lancateri c. Alkaloid [27], [29], [4] Kết quả của những công trình nghiên cứu về loài Lagerstroemia indica Linn. cho biết, thành phần hóa học chủ yếu của loài này là các alkaloid. Một số alkaloid đã được phân lập là: lagerin, o-metyllagerin. 4 Lagerin o-metyllagerin Hình 1.3. Một số alkaloid đã được phân lập từ loài Lagerstroemia indica Linn. Khi nghiên cứu lá của loài Lagerstroemia subcostata, Iida. H. và Comins D.L. đã phát hiện một số alkaloid khác như: subcosin I, lasubin I, lasubin II [4], subcosin II [23]. Còn Blomster R.N. và Zachrias D.E. đã phân lập được lythridin [27], lythrin [15] từ Lagerstroemia fauriei và decinin từ loài Lagerstroemia lanceolatum [17]. Subcosin I Lasubin I Subcosin II Lasubin II Hình 1.4. Một số alkaloid có trong lá của loàiLagerstroemia subcostata 5 Lythridin Lythrin Hình 1.5. Một số alkaloid đã được phân lập từ loài Lagerstroemia fauriei d.Tannin [ 8], [30], [33] Trong lá, vỏ của cây Bằng lăng nước đều có chứa tannin với thành phần rất phong phú và đa dạng, nhất là ở lá. Những tannin được phân lập từ lá, vỏ là dẫn xuất của acid gallic và catechin [30]. Acid gallic Catechin Hình 1.6. Một số tannin có trong lá và vỏ cây Bằng lăng nước Ngoài tannin, alkaloid, các acid và dẫn xuất, terpenoid đã đề cập ở trên, các nhà khoa học cũng đã nhận dạng và phân lập được alcol n-amylic [35], lageraxetal từ lá cây Bằng lăng nước và epiepoxydon [32] từ loài Lagerstroemia indica Linn. Alcol n- amylic Lageraxetal 6 Epiepoxydon Hình 1.7. Một số chất đã được phân lập từ lá cây Bằng lăng nước Theo các công trình nghiên cứu này thì thành phần hóa học chủ yếu của cây Bằng lăng nước là tannin. Ngoài ra còn có các amino acid, acid carboxylicvà acid mạch dài, v.v. 1.4.2. Nghiên cứu tại Việt Nam - Năm 2001, Đỗ Đình Rãng cùng các cộng sự trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 1 đã nhận dạng được 3 cấu tử, đồng thời xác định được hàm lượng của chúng trong tinh dầu và xác định được cấu trúc 1 chất trong dịch ngâm chiết n-butanol là 5,5,6-trimetyltridecanoat. - Đoàn Văn Tuấn tại Đại học Thái Nguyên đã xác định cấu trúc hóa học từ cành và lá cây Bằng lăng nước (Lagertroemia speciosa) của 5 hợp chất, đó là: βsitosterol; acid 3,7,8-tri-o-methylellagic; acid β-sitosterol-glucopyranoside; 2,7,8-tri-omethylellagic và cyclitol [9]. - Tôn Nữ Liên Hương tại Đại học Cần Thơ đã phân lập và định danh được ba chất từ vỏ cây Bằng lăng nước (Lagertroemia speciosa): stigmasterol; acid betulinic và hợp chất oleana-9(11),12-dien-3-ol [5]. 1.5. Công dụng của cây Bằng lăng nước Bằng lăng nước được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở Châu Mỹ, Ấn Độ, Philippines, ... để điều trị tiểu đường và khá nhiều bệnh khác như trị tiêu chảy, tim mạch, mụn nhọt, đặc biệt là dùng lá Bằng lăng nước làm trà để trị đau bao tử và bệnh tiểu đường [13]. Loài Bằng lăng này chứa acid corosolic ở mức cao, đây là hợp chất thiên nhiên được cho là có khả năng làm hạ mức đường trong máu [31], [34]. Hình 1.8. Acid corosolic Bằng lăng nước có nhiều công dụng làm thuốc tùy theo bộ phận dùng: Hạt gây ngủ; vỏ thân và lá làm thuốc hãm uống trị tiêu chảy; rễ có tác dụng kích thích và hạ nhiệt; quả dùng đắp ngoài trị bệnh áp-tơ miệng (tổn thương loét đau ở miệng); lá được 7 nhân dân các nước Philippines, Ấn Độ hãm uống như trà để chữa bệnh tiểu đường [38]. Nhiều nghiên cứu dược lý hiện đại trong và ngoài nước đã chứng minh thành phần acid corosolic có nhiều trong lá và quả già Bằng lăng nước có tác dụng làm giảm đường huyết khi nó vượt quá mức cho phép tương tự như tác dụng của insulin và giảm béo phì. Lý do chính khiến mỡ hình thành trong cơ thể là sự tích tụ quá nhiều carbohydrate và nhờ có tác dụng điều chỉnh đường huyết, chiết xuất lá Bằng lăng có thể ngăn cản sự tồn đọng carbohydrate đồng thời làm giảm sự hình thành mỡ. Hoạt chất này đã được nghiên cứu chiết xuất và sử dụng rộng rãi làm thuốc chữa tiểu đường và béo phì tại nhiều nước trên thế giới. Ngoài ra, các hợp chất tannin như ellagitannins, lagertannins, lagerstroemia trong lá Bằng lăng nước cũng được chứng minh có tác dụng làm hạ đường huyết. Trong lá Bằng lăng rất giàu acid valoneic dilactone (VAD) – chất dùng rất hiệu quả trong điều trị bệnh gout. VAD ngăn cản hoạt động của xanthine oxidase, enzyme xúc tác quá trình oxy hóa xanthine thành acid uric, từ đó ngăn chặn sự hình thành acid uric – nguyên nhân chính gây ra các chứng viêm sưng ở người bị gout. Hơn nữa, các kết quả nghiên cứu từ Nhật Bản vào năm 2004 đã chỉ ra rằng VAD ở lá Bằng lăng nước có khả năng ức chế xanthine oxidase mạnh hơn cả allopurinol và rất nhiều thuốc khác trong việc đặc trị bệnh gout. Các thành phần trong lá cây Bằng lăng nước rất có lợi đối với người mắc các bệnh đường tiết niệu. Các thành phần kháng khuẩn có trong lá Bằng lăng giúp phòng ngừa và chữa trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu (UTI). Người ta có thể sử dụng lá Bằng lăng bằng cách đun lá già với nước sôi trong 30 phút và uống nước luộc lá thay cho trà [27], [25], [22]. 8 Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ, thiết bị, hóa chất 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng được nghiên cứu là lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa). Mẫu nghiên cứu được thu hái vào tháng 3 năm 2015 tại đường Trịnh Công Sơn, phường Phú Cát, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế. Hình 2.1. Lá, cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Sau khi thu hái mẫu, nguyên liệu được lau sạch, phơi khô và sấy ở 60 oC, sau đó nghiền thành bột thô rồi bảo quản ở nơi khô thoáng. 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất - Dụng cụ, thiết bị: cột sắc ký, cân điện tử (độ chính xác 0,01 g), cân phân tích (độ chính xác 0,0001 g), bộ chưng cất TD, bộ chưng cất đơn, máy cất quay áp suất thấp. Ngoài ra còn dùng máy sấy, các dụng cụ thuỷ tinh, v.v... - Hóa chất: ethanol 96o (Việt Nam), n-hexane (Hàn Quốc), ethyl acetate (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), CHCl3 (Trung Quốc), CH2Cl2 (Trung Quốc), acetone (Trung Quốc), CH3OH (Trung Quốc). - Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel DC_Alufolien 60 F – 254 (tấm 20x20 cm của Merck 1.05715), có độ dày 0,2 mm và phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch 9 H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu. - Phân lập các chất bằng sắc ký cột thường sử dụng chất hấp phụ pha thường silica gel cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm của Merck với các loại cột sắc ký có kích thước khác nhau. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Xác định độ ẩm và độ tro của mẫu lá cây Bằng lăng nước, 2. Định tính một số lớp chất trong các cao chiết, 3. Tách chiết các phân đoạn bằng phương pháp ngâm chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần, 4. Nghiên cứu tách và phân lập các cấu tử trong cao chiết bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu hái và xử lý mẫu 2.3.1.1. Lấy mẫu - Mẫu được lấy vào tháng 3/2015 tại đường Trịnh Công Sơn, phường Phú Cát, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế. - Bộ phận sử dụng: lá. - Tiêu chuẩn lựa chọn: lá tốt, tươi, chưa vàng, không bị sâu. Đây là giai đoạn nồng độ các hoạt chất trong lá tăng cao nhất. - Mẫu nguyên liệu được ThS. GVC. Nguyễn Việt Thắng, cán bộ giảng dạy thuộc Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Huế định danh đúng là cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa). 2.3.1.2. Xử lý mẫu Mẫu lá sau khi thu hái được phơi khô tự nhiên, sau đó được sấy ở 60 0C, nghiền nhỏ và bảo quản ở nơi khô thoáng. 2.3.1.3. Phương pháp khối lượng để xác định độ ẩm của mẫu lá khô (a) Nguyên tắc 10 Độ ẩm được xác định bằng phương pháp khối lượng. Cân khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi, khối lượng hao hụt sau khi sấy được xem là khối lượng nước tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu. (b) Tiến hành - Rửa sạch cốc cân, sấy khô ở nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không đổi (khoảng 1,5 giờ) và xác định khối lượng là mo (g). - Cho một lượng nguyên liệu cần xác định độ ẩm vào cốc cân đã sấy đến khối lượng không đổi ở trên, xác định khối lượng mẫu nguyên liệu và cốc cân là m (g), cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105 0C và sấy đến khối lượng không đổi (khoảng 5 - 6 giờ), xác định khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g). - Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu theo công thức sau: Độ ẩm (%) = m - m’ x 100% m - mo Trong đó: mo: khối lượng cốc cân đã sấy khô đến khối lượng không đổi, m : khối lượng cốc và mẫu lá trước khi sấy, m’: khối lượng cốc và mẫu lá sau khi sấy đến khối lượng không đổi. 2.3.2. Phương pháp khối lượng để xác định độ tro của nguyên liệu [11] - Nguyên tắc: Tro hóa mẫu ở nhiệt độ 5250C. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng. - Tiến hành: + Rửa sạch cốc cân, sấy khô ở nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không đổi (khoảng 1,5 giờ) và xác định khối lượng là mc (g). + Cho một lượng nguyên liệu cần xác định độ tro vào cốc cân đã sấy đến khối lượng không đổi ở trên, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105 0C và sấy đến khối lượng không đổi thu được m0. + Đốt trên bếp đến than hóa. + Nung ở 5250C đến khi thu được tro màu trắng ngà, xác định khối lượng cốc và tro sau khi nung là m (g). 11 + Xác định độ tro tương đối của nguyên liệu theo công thức sau: Độ tro (%) = Trong đó: m  mc 100% m0  mc mc: khối lượng cốc sấy khô đến khối lượng không đổi (g), m0: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy ở nhiệt độ 100 – 105 0C đến khối lượng không đổi (g), m: khối lượng cốc và tro (g). 2.3.3. Phương pháp chiết rắn – lỏng và chiết lỏng–lỏng để tách các cao [18], [27] Quy trình xử lý nguyên liệu và tách các cao tiến hành theo sơ đồ ở hình 2.2. Tiến hành chiết bằng ethanol 96o bằng phương pháp chiết siêu âm. Cho bột nguyên liệu vào trong bình thủy tinh rồi đặt vào thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ < 50 0C. Tiến hành lọc dịch chiết lần lượt bằng bông, giấy lọc. Sau đó cô quay dịch chiết thu được cao ethanol. Cao ethanol được chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate và n-butanol thu được các dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và n-butanol. Cuối cùng cất đuổi dung môi để thu được các cao tương ứng. 12 Mẫu nguyên liệu 1. Phơi, sấy khô và nghiền mịn. 2. Ngâm chiết bằng ethanol 96o, 5 lít x 4 lần 3. Lọc 4. Cất đuổi dung môi Bã rắn Cao ethanol Phân tán trong nước Dịch nước Lắc chiết với n-hexane (1L x 10 lần) Dịch n-hexane Dịch nước Cô dung môi Lắc chiết với ethyl acetate (1L x 10 lần) Cao n-hexane Dịch ethyl acetate Dịch nước Cô dung môi Lắc chiết với n-buthanol (1L x 9 lần) Cao ethyl acetate Dịch n-buthanol Dịch nước Cô dung môi Cao n-buthanol Hình 2.2. Sơ đồ chiết rắn – lỏng và lỏng – lỏng lá cây Bằng lăng nước 13 2.3.4. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong cao tổng và các cao phân đoạn [7] 2.3.4.1. Định tính phenolic Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm từng giọt dung dịch FeCl 3 0,1% nếu dung dịch xuất hiện kết tủa màu xanh nâu: phản ứng dương tính. 2.3.4.2. Định tính nhóm chất flavonoid (a) Phản ứng Shinoda Cho 1 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg hoặc Zn và vài giọt HCl đậm đặc rồi đun cách thủy, khoảng vài phút sau nếu dung dịch đổi sang màu hồng: phản ứng dương tính. (b) Phản ứng với thuốc thử KOH/ethanol 96o Thuốc thử KOH/ethanol 96o: bao gồm ethanol 96ođược trộn với KOH theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích. Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm từng giọt dung dịch thuốc thử. Nếu dung dịch đổi sang màu vàng chứng tỏ có flavonoid. 2.3.4.3. Định tính nhóm chất alkaloid Chuẩn bị thuốc thử Dragendorff. Thuốc thử Dragendorff được pha từ hai dung dịch sau: - Dung dịch 1: Hòa tan 8,0 g Bi(NO3)3 trong 20 mL HNO2. - Dung dịch 2: Lấy 27,2 g KI hòa tan trong 50 mL nước cất. Cho hai dung dịch trên trộn lẫn vào nhau và định mức bằng nước cất đến 100 mL thu được thuốc thử Dragendorff. Cho 1 mL dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendorff, nếu thấy kết tủa màu đỏ da cam: phản ứng dương tính. 2.3.4.4. Định tính nhóm chất steroid Lấy 1 g cao hòa tan trong 10 mL CHCl3, lọc lấy phần dịch. Pha thuốc thử Liebermann – Burchard: anhydride acetic (1 mL), CHCl 3 (1 mL), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Tiến hành: lấy 1 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm. Sau đó, thêm tiếp thuốc thử vào ống nghiệm trên, lắc đều trong 5 phút, để ổn định trong 20 phút. Quan sát sự 14 thay đổi màu và cường độ màu. Nếu xuất hiện các màu xanh nhạt, lục, hồng, cam hoặc đỏ, các màu này bền vững trong một thời gian: phản ứng dương tính. 2.3.4.5. Định tính nhóm chất terpenoid Lấy 5 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 2 mL CHCl3 và 3 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc. Nếu dung dịch xuất hiện màu nâu đỏ: phản ứng dương tính. 2.3.4.6. Định tínhsaponin Lấy cao ethanol hòa tan trong nước hoặc lấy dịch nước rồi dùng pipet lấy 2 mL dịch cho vào ống nghiệm, bịt miệng ống nghiệm, lắc mạnh trong 1 phút, để yên một lúc rồi quan sát cột bọt trong ống nghiệm. Nếu cột bọt bền vững: phản ứng dương tính. 2.3.4.7. Định tính glycoside tim Phản ứng với thuốc thử Baljet Thuốc thử Baljet: pha 1 thể tích dung dịch acid pycric 1% với 9 thể tích dung dịch NaOH 10%. Cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm từng giọt thuốc thử, nếu dung dịch xuất hiện màu hồng: phản ứng dương tính. 2.3.4.8. Định tính acid hữu cơ Lấy 5 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một ít tinh thể NaHCO3, nếu thấy bọt khí xuất hiện: phản ứng dương tính. 2.3.4.9. Định tính carbohydrate Lấy 1 mL dịch chiết nước, thêm vào đó 1 mL phenol 5%, rồi thêm tiếp 5 mL H2SO4 đậm đặc. Xuất hiện màu vàng da cam: phản ứng dương tính. 2.3.4.10. Định tính đường khử Lấy 4 – 5 mL dịch chiết cho vào 4 – 5 mL thuốc thử Fehling, đun cách thủy 2 – 3 phút, có kết tủa màu đỏ gạch: phản ứng dương tính. 2.3.5. Sắc ký bản mỏng và sắc ký cột [7], [10], [11] 2.3.5.1. Sắc ký bản mỏng (SKBM) SKBM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính, phiến kim loại hoặc 15 phiến nhựa. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ thích hợp cho yêu cầu phân tích. Trong quá trình di chuyển qua lớp chất hấp phụ, các thành phần trong hỗn hợp mẫu được di chuyển theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau tuỳ theo đặc điểm của chúng. Kết quả ta thu được sắc đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự phân tách chất trên lớp mỏng bao gồm cơ chế hấp phụ, phân bố trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời nhiều cơ chế tuỳ thuộc vào chất làm pha tĩnh hoặc dùng dung môi làm pha động. Các chất hấp phụ thường dùng làm pha tĩnh là silica gel G, cellulose hay nhôm oxide. Pha động còn tuỳ thuộc vào hỗn hợp chất cần phân tách. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tách là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ đoạn đường di chuyển của chất thử và đoạn đường di chuyển của dung môi Rf = a / b (0 ≤ Rf ≤ 1) Trong đó: a: đoạn đường di chuyển của chất (cm), b: đoạn đường di chuyển của dung môi (cm). 2.3.5.2. Sắc ký cột (SKC) Sắc ký cột là phương pháp sắc ký để tách cấu tử hoặc nhiều cấu tử ra khỏi hỗn hợp của chúng trên pha tĩnh (rắn) được nhồi trong cột bằng cách rửa giải cột với pha động là dung môi di chuyển qua cột. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”, nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hay theo cơ chế phân bố (cột phân bố). Pha tĩnh-chất hấp phụ: các chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi trong SKC là silica gel, nhôm oxide và florisil (MgSiO3). H2O. - Pha động - dung môi rửa giải: + Dung môi sử dụng trong SKC phải tinh khiết. + Để chọn dung môi thích hợp dùng trong SKC, người ta dựa vào kỹ thuật 16 SKBM để khảo sát khả năng tách chất của dung môi. + Dung môi thích hợp: các vệt cần tách có vết rõ, gọn và Rf <0,5. - Lượng chất hấp phụ và kích thước cột: + Tỷ lệ khối lượng chất hấp phụ/khối lượng mẫu tối ưu khoảng từ 15/1 - 25/1. + Cột sắc ký thích hợp: chiều cao phần chất hấp phụ trong cột (h)/đường kính cột (d)= 8/1- 15/1. - Vận tốc rửa giải: cần điều chỉnh phù hợp sao cho các chất vừa đủ thời gian để đạt được cân bằng giữa pha động và pha tĩnh. - Nếu nhanh quá, chưa đủ thời gian thiết lập cân bằng, chậm quá thì các chất trong hỗn hợp sẽ bị phân tán lẫn vào nhau trong dung môi rửa giải. - Vận tốc rửa giải với các cột nhỏ thường khoảng 45 – 50 giọt/phút. Với cột lớn cỡ Φ = 4 - 6cm, vận tốc khoảng 40 giọt/phút. - Kĩ thuật nhồi cột: gồm hai phương pháp sau: (1). Phương pháp nhồi khô: + Đổ dung môi vào cột. + Mở khóa cho dung môi chảy ra chầm chậm bên dưới, rồi cho liên tục từng lượng nhỏ chất hấp phụ ở dạng khô vào đầu cột, đồng thời dùng bóp cao su gõ nhẹ vào thành ngoài của cột. + Khi chất hấp phụ đạt đến chiều cao thích hợp thì ngưng không cho thêm nữa. + Tiếp tục cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần để cột được nén chặt. (2). Phương pháp nhồi ướt: + Trong một cốc đã chứa sẵn dung môi (dung môi là loại dung môi ít phân cực nhất được dùng để bắt đầu cho quá trình rửa giải cột), cho chất hấp phụ vào cốc đều đặn. Mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khuấy nhẹ đều. Lưu ý: Không được thực hiện ngược lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp phụ bởi vì chất hấp phụ gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp phụ vón cục, sẽ không đồng nhất. + Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá loãng. + Đổ dung môi vào cột. + Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp đó vào cột, vừa 17 mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một cốc trống để ở bên dưới cột, dung môi này dùng lại để rót trở lại trên đầu cột. + Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một bóp cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột. + Sau khi nạp xong, tiếp tục cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt khít, cho đến khi thấy chất hấp phụ trong cột không phân lớp. Lưu ý: Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột hứng, lượng dung môi này được sử dụng lại để rót trở lại trên đầu cột, không được để cho đầu cột bị khô. + Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải phẳng. Nếu mặt thoáng không phẳng phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất hấp phụ ở trên đầu cột, để yên, chất hấp phụ lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng. + Đối với loại chất hấp phụ có thể trương nở (chất hấp phụ trong sắc ký lọc gel và trao đổi ion), cần có thời gian để gel trương nở. Người ta thường thêm đủ lượng dung môi để làm thành hỗn hợp sệt và để yên suốt một đêm, hôm sau thêm dung môi vào để hỗn hợp đó có thể rót chảy, để rót vào cột. 2.3.6. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần hóa học của các cao chiết - Nguyên lý: Là kỹ thuật tách chất từ hỗn hợp các cấu tử ở dạng hơi nhờ vào sự di chuyển khác nhau của chúng qua cột chứa pha tĩnh là chất lỏng hay rắn và pha động ở dạng khí. Chúng được phát hiện sau khi rửa giải ở cuối cột. Bộ phận phát tín hiệu sẽ sinh ra một tín hiệu điện, được khuếch đại và được ghi lại dưới dạng sắc đồ biểu diễn nồng độ cấu tử cần tách theo thời gian. Thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho các cấu tử cần tách, dùng để định tính, còn diện tích peak là thước đo định lượng cho từng cấu tử trong hỗn hợp. - Các cao được phân tích trên máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2, thành phố Đà Nẵng. 18 Đối với GC: cột HP-5MS: 30 m x 250 µm x 0,25 µm (chiều dài-đường kính trong-bề dày lớp phim); nhiệt độ ban đầu là 280oC, chế độ chia dòng (split), tỉ lệ chia 4:1; khí mang He, áp lực khí mang 7 psi; chương trình nhiệt cho buồng cột: nhiệt độ đầu cột 50oC (giữ 10 phút), tăng lên 120oC (tăng 7oC/phút, giữ 10 phút), tăng lên 200oC (tăng 4oC/phút, giữ 10 phút), tăng lên 250oC (tăng 5oC/phút, giữ 10 phút), tăng lên 300oC (tăng 20oC/phút, giữ 10 phút); nhiệt độ đường truyền là 300oC. Đối với MS: chạy chế độ quét: khối lượng từ 28-600 M/z; nhiệt độ MS nguồn là 230oC; nhiệt độ MS trong là 150oC. 19 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu hái, định danh và xử lý mẫu 3.1.1. Thu hái Đối tượng được nghiên cứu là lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa). Mẫu nghiên cứu được thu hái vào tháng 3 năm 2015 tại đường Trịnh Công Sơn, phường Phú Cát, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế. 3.1.2. Mô tả và định danh 3.1.2.1. Mô tả Hình 3.1. Lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) dùng làm nguyên liệu - Lá cây có màu xanh lục, dài từ 8 đến 15cm, rộng từ 3 đến 7cm, hình bầu dục hay hình giáo dài, cứng, mặt lá nhẵn, cuống to. Lúc này, cây ở tình trạng: lá già trên cây nhiều, có nhiều lá chuyển sang màu tím, đỏ, cây không còn hoa, các quả già chuyển sang màu đen. 3.1.2.2. Định danh Mẫu nguyên liệu được ThS. GVC. Nguyễn Việt Thắng, cán bộ giảng dạy thuộc Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Huế định danh đúng là cây Bằng lăng nước, có tên khoa học là Lagerstroemia speciosa(L.) Pers., thuộc bộ Đào 20 kim hương (Myrtales), họ Bằng lăng (Lythraceae), chi Tử vi (Lagerstroemia), loài Lagerstroemia speciosa. 3.1.3. Xử lí mẫu Lá sau khi thu hái được phơi khô tự nhiên trong 72 giờ để giảm lượng nước trong mẫu, sau đó được đem xay nhỏ và bảo quản ở nơi khô ráo. Khối lượng mẫu khô là 5,8 kg từ 16,8 kg lá tươi. 3.2. Độ ẩm của mẫu lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Độ ẩm của mẫu lá được xác định dựa vào lý thuyết mục 2.3.1.3 được trình bày ở bảng 3.1: Bảng 3.1. Độ ẩm trung bình của lá cây Bằng lăng nước Số thứ tự thí nghiệm 1 2 a (g) m (g) m1 (g) Độ ẩm (%) 62,20 61,74 64,19 63,72 64,10 63,61 4,52 5,56 Độ ẩm TB (%) 5,04 ± 0,74 Trong đó: a : khối lượng cốc cân đã sấy khô đến khối lượng không đổi, m : khối lượng cốc và mẫu lá trước khi sấy, m1: khối lượng cốc và mẫu lá sau khi sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm trung bình của mẫu lá cây Băng lăng nước tại thời điểm nghiên cứu là 5,04 ± 0,74%.Đối chiếu với tài liệu [2] thì độ ẩm của mẫu lá ≤ 10% cho thấy mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng cho phép. 3.3. Độ tro của mẫu lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Tro là thành phần còn lại của mẫu sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ, gồm chủ yếu là các loại muối khoáng. Việc xác định hàm lượng tro cho biết hàm lượng muối khoáng có trong lá, là thông tin quan trọng khi sử dụng lá làm chế phẩm trà để uống chữa bệnh. Giá trị độ tro của lá cây Bằng lăng nước được trình bày ở bảng 3.2: Bảng 3.2. Độ tro của mẫu lá cây Bằng lăng nước Số thứ tự thí nghiệm mc(g) mo(g) m (g) 21 Độ tro (%) Độ tro TB (%) 1 18,42 20,39 18,51 4,57 4,61±0,05 2 19,90 21,84 19,99 4,64 Trong đó: mc: khối lượng cốc sấy khô đến khối lượng không đổi (g), m0: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy ở nhiệt độ 100 – 105 oC đến khối lượng không đổi (g), m: khối lượng cốc và tro sau khi nung ở 525oC (g). Nhận xét: Độ tro trung bình của mẫu lá cây Bằng lăng nước tại thời điểm nghiên cứu là 4,61± 0,05%. Điều này chứng tỏ trong lá có khá nhiều chất khoáng. Vì vậy lá thường được ứng dụng làm thực phẩm trong sinh hoạt đời sống, có lợi cho sức khỏe con người. 3.4. Chiết phân đoạn các hợp chất từ lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Theo tài liệu [9], chúng tôi tiến hành ngâm chiết mẫu bằng thiết bị siêu âm. Nguyên liệu khô được ngâm trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ ≤ 70oC bằng ethanol 96o, mỗi đợt tiến hành ngâm chiết trong 1,5 giờ, đến khi dịch thu được có màu nhạt thì dừng. Chúng tôi chiết được tất cả 4 đợt với tổng lượng ethanol 96o ngâm tiêu tốn là 20 lít. Số đợt ngâm chiết tốt nhất là từ 4- 5 đợt, nếu nhiều hơn sẽ chiết ra rất nhiều nhựa, không tốt cho quá trình phân lập sau này. Sau khi ngâm nguyên liệu khô, gộp tất cả các dịch chiết thu được, đem lọc rồi tiến hành cô quay chân không dưới áp suất thấp thu được cắn ở dạng sệt. Đây chính là cao ethanol, khối lượng cao thu được là 401,34 g. Quá trình tách chiết cao được tiến hành theo sơ đồ hình 2.2 mục 2.3.3. Cắn được phân tán trong 1 lít nước, thu được dịch. Tiến hành chiết phân đoạn trong phễu chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần, lần lượt với n-hexane (1 lít x 10lần), ethyl acetate (1 lít x 9 lần), n-butanol (1 lít x 5 lần). Sau khi để phân lớp hoàn toàn, dựa vào trọng lượng riêng của các dịch n-hexan, ethyl acetate, n-butanol so với nước, ta có thể xác định được các dung môi đem chiết đều nhẹ hơn nước nên phân bố ở trên, ở giữa là lớp cắn và phần dịch dưới đáy là nước (sau khi chiết xong các chất). Tiến hành tách riêng phần dung môi hữu cơ ở trên và cô quay dưới áp suất thấp thu được cắn tương ứng với mỗi loại dung môi và phần nước còn lại. - Khối lượng lá cây Bằng lăng nước khô đem ngâm chiết: m = 3,0 kg. - Khối lượng các cao sau khi cô quay được thể hiện ở bảng 3.3. 22 Bảng 3.3. Khối lượng cao tổng và các cao phân đoạn Loại cao Cao tổng Khối lượng (g) Hàm lượng (%) 401,34 Cao phân đoạn n-hexane ethyl acetate n-butanol 50,07 99,84 63,52 14,04 (so với mẫu khô ban đầu) 1,76 3,50 2,23 3.5. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên 3.5.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên từ cao ethanol tách chiết được Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên trong cao ethanol sau khi tách chiết từ lá cây Bằng lăng nước được trình bày ở bảng 3.4. Bảng3.4. Kết quả định tính các nhóm chức hữu cơ thiên nhiên từ cao ethanol STT Nhóm chất được định tính Thuốc thử/phản ứng Kết quả Kết luận FeCl3 0,1% ++ Có Shinoda ++ + +++ 1 Phenolic 2 Flavonoid 3 Alkaloid KOH/ EtOH Dragendorff 4 Steroid CHCl3, H2SO4 đđ + Có 5 Terpenoid Liebermann – Burchard +++ Có 6 Saponin Tạo bọt 7 Glycoside tim Baljet 8 Acid hữu cơ Tinh thể NaHCO3 9 Carbohydrate Phenol- acid sulfuric +++ 10 Đường khử Fehling * Ghi chú: +++: Phản ứng dương tính rất rõ + : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ Có Có Không có Không có Không có Có Không có - : Phản ứng âm tính Nhận xét: Trong quá trình nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa), định tính các hợp chất thiên nhiên có trong cao tổng là công việc cần thiết đầu tiên trước khi tiến hành chiết phân đoạn. Việc xác định sơ bộ các nhóm chất này sẽ góp phần định hướng cho quá trình nghiên cứu, chiết xuất và phân lập các hoạt chất có tác dụng sinh học từ lá cây Bằng lăng nước trong các công đoạn tiếp theo. Kết quả định tính cho thấy trong cao ethanol của lá cây Bằng lăng nước có các nhóm hợp chất hữu cơ: phenolic, flavonoid, alkaloid, steroid, terpenoid và 23 carbohydrate, không thể định tính được saponin, glycoside tim, acid hữu cơ và đường khử. 3.5.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thiên nhiên từ các cao chiết phân đoạn nhexane, ethyl acetate, n-butanol Kết quả thực hiện phép định tính dịch chiết được mô tả trong bảng 3.5. Hình ảnh mẫu trước và sau khi thực hiện phép định tính dịch chiết được mô tả trong hình 3.2. (1) Cao n-hexane (a) Mẫu trắng (2) Cao ethyl acetate (b) Mẫu phân tích (3) Cao n-butanol - Định tính phenolic a 1 - b a b b a 2 3 Định tính flavonoid + Phản ứng với thuốc thử shinoda: a b b a a b + Phản ứng với thuốc thử KOH/ EtOH - Định tính alkaloid 2 1 c 3 1 + Phản ứng với thuốc thử KOH/ethanol a c b c a c b c a c b c 24 1 2 3 - Định tính alkaloid a c - b c a c b c 1 c a c b c 2 c Định tính terpenoid a c b c 3 c a c b c 1 c - 3 c Định tính terpenoid - b c 2 c Định tính steroid b c a c b c 1 c a c - a c b c a c 3 c 2 c Định tính saponin a c b c a c b c a c b c 25 1 c 2 c 3 c - Định tính glycoside tim - 1 c 2 c b c b c Định tính acid hữu cơ 1 c - b c a c 3 c b c 3 c 2 c Đính tính carbohydrate a c b c 1 c - b c a c b c a c a c b c 2 c b c a c 3 c Định tính đường khử b b b 26 1 2 3 Hình 3.2. Hình ảnh định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong các cao phân đoạn Kết quả định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày ở bảng 3.5 như sau: Với: H: cao n-hexane E: cao ethyl acetate B: cao n-butanol Bảng 3.5. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao chiết phân đoạn STT Định tính Thuốc thử/phản nhóm chất ứng Kết quả Kết luận H E B H E B FeCl3 0,1% - - ++ Không Không Có Shinoda - + +++ Không Có Có KOH/ EtOH - + +++ Không Có Có Dragendorff Liebermann – - + + Không Có Có + ++ + Có Có Có - ++ - Không Có Không - - - Không Không Không 7 Glycoside tim Baljet 8 Acid hữu cơ Tinh thể NaHCO3 Phenol- acid 9 Carbohydrate sulfuric - - - Không Không Không Không Không Không - + + Không 10 Đường khử - - - Không 1 Phenolic 2 Flavonoid 3 Alkaloid 4 Steroid 5 Terpenoid 6 Saponin Burchard CHCl3, H2SO4 đđ Tạo bọt Fehling Có Có Không Không Nhận xét: - Trong cao n-hexane có steroid, không thể định tính được hợp chất alkaloid, terpenoid, flavonoid, phenolic,… 27 - Trong cao ethyl acetate có flavonoid, alkaloid, steroid, terpenoid và carbohydrate, không thể định tính được hợp chất phenolic,… - Trong cao n-butanol có flavonoid, alkaloid, steroid, phenolic, carbohydrate, không thể định tính được hợp chất terpenoid,… 3.6. Định danh các hợp chất dễ bay hơi trong cao n-hexane, ethyl acetate và nbutanol bằng GC-MS 3.6.1. Định danh một số hợp chất trong cao n-hexane bằng GC-MS Kết quả ghi GC – MS được thể hiện ở phụ lục 1, qua đó chúng tôi đã phát hiện và định danh được một số hợp chất được trình bày trên bảng 3.6 như sau: Bảng 3.6. Các hợp chất được định danh trong cao n-hexane lá cây Bằng lăng nước ST Thời gian lưu Diện tích Hợp chất T 1 2 3 4 ( phút) 6,955 17,262 18,287 18,464 peak (%) 0,24 0,15 0,44 0,29 1-methyl-4-(1-methylethenyl)-cyclohexene 1,6-anhydro-β-D-glucopyranose Methyl dodecanoate 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-2(4H)- 0,52 1,55 benzofuranone tetradecanoic acid (1α,2β,5α)-2,6,6- 4,69 10,77 2,48 2,97 2,00 13,31 0,54 10,53 2,93 2,48 20,09 trimethylbicyclo[3.1.1]heptane n-hexadecanoic acid tetramethyl-2-hexadecen-1-ol (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid (E)-9-octadecenoic acid 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl]phenol Squalene γ-tocopherol Vitamin E Campesterol Stigmasterol β-sitosterol 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 24,507 26,438 29,601 33,598 34,413 34,689 35,471 40,998 42,579 43,259 44,324 44,594 45,376 Nhận xét: Qua kết quả GC-MS của cao n-hexane chúng tôi đã định danh được 17 hợp chất, trong đó β-sitosterol chiếm hàm lượngcao nhất có thời gian lưu là 45,376 phút. β-sitosterol có khả năng làm giảm lượng cholesterol hấp thu trong chế độ ăn uống và có tác dụng ức chế và làm giảm chứng tăng sản tuyến tiền liệt. Ngoài ra, 28 trong cao n-hexane còn có squalene (là một chất chống oxi hóa, được sử dụng như là một chất bổ trợ vắc-xin), vitamin E, tetramethyl-2-hexadecen-1-ol cũng chiếm hàm lượng cao. 3.6.2. Định danh một số hợp chất trong cao ethyl acetate bằng GC-MS Kết quả ghi GC-MS được thể hiện ở phụ lục 2, qua đó chúng tôi đã phát hiện và định danh được một số hợp chất được trình bày trên bảng 3.7 như sau: Bảng 3.7. Các hợp chất được định danh trong cao ethyl acetate lá cây Bằng lăng nước Diện ST Thời gian lưu T (phút ) 1 7,041 peak (%) 0,39 2 7,142 0,36 3 10,754 2,01 4 10,928 0,59 5 6 7 8 12,491 12,898 14,288 17,649 0,31 1,89 2,73 2,71 9 23,819 1,19 10 24,475 0,44 methoxyphenol Tetradecanoic acid 11 25,159 2,08 m-hydroxycinnamic acid 12 26,437 3.67 13 14 29,536 34,526 1,42 3,01 15 35,507 11,89 16 43,065 1,64 methoxyphenyl)methyl)dihydro- 1,16 10,68 2(3H)-furanone Vitamin E β-sitosterol 17 18 43,223 45,302 tích Hợp chất Phenylmethanol (±)-dihydro-3-hydroxy-4,4-dimethyl2(3H)-furanone 2,3-dihydrobenzofuran 5-hydroxymethyl-2furancarboxaldehyde Salicylic acid 2-methoxy-4-vinylphenol 1,2,3-trihydroxybenzene 1,6-anhydro-β-D-glucose 4-((1E)-3-hydroxy-1-propenyl)-2- (1α,2β,5α)-2,6,6trimethylbicyclo[3.1.1]heptane n-hexadecanoic acid (E)-9-octadecenoic acid 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2yl]phenol 3R,4R-bis((4-hydroxy-3- 29 Nhận xét: Qua kết quả GC-MS, chúng tôi đã định danh được 18 hợp chất trong cao ethyl acetate, trong đó 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl]phenol chiếm tỉ lệ lớn nhất và có thời gian lưu là 10,013 phút. Ngoài ra còn có β-sitosterol cũng chiếm tỉ lệ cao,… 3.6.3. Định danh một số hợp chất trong cao n-butanol bằng GC-MS Kết quả ghi GC-MS được thể hiện ở phụ lục 3, qua đó chúng tôi đã phát hiện và định danh được một số hợp chất được trình bày trên bảng 3.8 như sau: Bảng 3.8. Các hợp chất được định danh trong cao n-butanol lá cây Bằng Lăng nước Thời gian lưu Diện tích 1 2 3 4 5 6 7 (phút) 3,991 5,820 6,391 7,038 7,173 8,142 8,636 peak (%) 2,07 0,35 3,78 7,25 0,86 0,67 0,58 8 9,316 1,01 9 10 11 12,902 13,749 34,496 0,94 0,55 035 12 35,638 6,74 13 45,274 0,58 STT Hợp chất Furan-2-carboxaldehyde 5-methyl-2-furancarboxaldehyde Butyl butanoate 2-ethylhexan-1-ol Phenylmethanol 2-methoxyphenol 2-furanmethanol 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6methyl-4(4H)-pyranone 4-ethenyl-2-methoxyphenol 2,6-dimethoxyphenol (9Z)-octadec-9-enoic acid 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2yl]phenol β-sitosterol Nhận xét: Kết quả GC-MS cao n-butanol đã định danh được 13 hợp chất, trong đó 2-ethylhexan-1-ol chiếm hàm lượng cao nhất. Ngoài ra còn có 4-[2-(4hydroxyphenyl)propan-2-yl] phenol cũng chiếm hàm lượng tương đối cao. Kết luận: - Từ kết quả GC-MS thu được ở trên, chúng tôi thấy rằng: Trong cao ethyl acetate định danh được nhiều hợp chất nhất trong ba cao phân đoạn. Hợp chất βsitosterol chiếm hàm lượng cao nhất trong cao n-hexane và chiếm hàm lượng cao thứ hai trong cao ethyl acetate. Trong cao n-butanol vẫn còn xuất hiện cấu tử này. Theo chúng tôi, do hàm lượng β-sitosterol trong lá cây Bằng lăng nước khá lớn. Ngoài ra có 30 thể quá trình tách chiết chưa triệt để nên chất này vẫn còn có mặt trong cao n-butanol. Cũng như vậy, cấu tử 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl] phenol chiếm hàm lượng cao nhất trong cao ethyl acetate và chiếm hàm lượng cao thứ hai (sau 2-ethylhexan-1ol) trong cao n-butanol. - Khi đối chiếu với kết quả định tính ở mục 3.5, các phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy: đa số các lớp chất đã được định tính đều có mặt trong kết quả GCMS. Khi định tính, chúng tôi không định tính carotenoid nhưng lại phát hiện được squalene trong cao n-hexane với hàm lượng lớn. - Kết quả đã định danh được tất cả 36 chất trong 3 cao phân đoạn. 3.7. Khảo sát dung môi SKBM cao ethyl acetate Để chuẩn bị tách các cấu tử trong cao ethyl acetate của lá cây Bằng lăng nước, chúng tôi tiến hành SKBM, làm cơ sở cho việc sắc ký cột. Chuẩn bị mẫu: Hòa tan một ít cao ethyl acetate trong ethyl acetate tinh khiết đến khi dung dịch đồng nhất. Theo tài liệu tham khảo [9], cao ethyl acetate đã được SKBM và SKC với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate = 15/1. Vì vậy để thăm dò, ban đầu chúng tôi tiến hành SKBM với hệ dung môi như trên, tuy nhiên kết quả chất không bật gốc. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khảo sát với hệ dung môi n-hexane/acetone = 15/2. Kết quả thu được: các vệt không tách rõ và đa số nằm sát vạch xuất phát. Vì vậy, chúng tôi tăng độ phân cực của hệ dung môi như sau: Chuẩn bị bình sắc ký: khảo sát qua các hệ dung môi khác nhau Hệ I: n-hexane/acetone = 5/1 (v/v) Hệ II: n-hexane/acetone = 3/1 (v/v) Hệ III: n-hexane/acetone = 2/1 (v/v) Hệ IV: n-hexane/acetone = 1/1 (v/v) Hệ V: n-hexane/acetone = 1/2 (v/v) Các bản mỏng sau khi triển khai sắc ký được hiện vết các cấu tử bằng cách soi đèn UV hoặc hiện bằng thuốc thử H2SO4 10%/ethanol. Qua khảo sát các hệ dung môi với tỉ lệ khác nhau, chúng tôi có được kết quả ở bảng 3.9 như sau: 31 Bảng 3.9. Kết quả SKBM cao ethyl acetate với các hệ dung môi khảo sát tương ứng STT Hệ dung môi Hiện bằng H2SO4 10%/ethanol 1 2 3 4 5 (I) (II) Hệ I Hệ II Hệ III Có 2 vệt tròn, tách rõ Có 3 vệt tròn, tách rõ Có 3 vệt tròn, tách rõ, Hệ IV Hệ V kéo dài đến tuyến dung môi Có 5 vệt, không tách rõ 2 vệt mờ, tách rõ (III) (IV) (V) Hình 3.3. Sắc ký đồ của cao ethyl acetate khi SKBM với các hệ dung môi khác nhau Dựa vào sắc ký đồ chúng tôi nhận thấy 2 hệ: II và III là có khả năng tách chất, do đó bước đầu chúng tôi đã chọn hệ II: n-hexane/acetone = 3/1 để triển khai sắc ký cột. 3.8. Sắc ký cột với cao ethyl acetate - Vì lượng cao ethyl acetate tương đối lớn nên chúng tôi dùng phương pháp sắc ký nhanh cột khô để cắt lớp các cấu tử,với cột sắc ký được sử dụng có Φ = 7,5 cm. - Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt. + Đường kính trong của cột: Φ = 7,5 cm + Lượng silica gel đưa vào cột: 20 g + Chiều cao lượng mẫu nạp vào cột : h =4cm + Khối lượng mẫu nạp lên cột: 60 g cao + 80 g silicagel 32 - Rửa giải cột bằng các dung môi và hệ dung môi có độ phân cực tăng dần:  n-hexane/acetone = 5/1 (v/v) (1 lít)  n-hexane/acetone = 3/1 (v/v) (1 lít)  n-hexane/acetone = 1/1 (v/v) (1 lít)  n-hexane/acetone= 1/5 (v/v) (1 lít). - Khi tiến hành rửa giải cột, khóa cột được mở hoàn toàn để tốc độ rửa giải lớn nhất. Sau quá trình SKC, chúng tôi thu được dịch màu vàng, trong suốt, tốc độ rửa giải khá chậm và sau đó ngừng hẳn (có thể do hạt silica gel quá nhỏ 0,015 – 0,040 mm của Merck). Chúng tôi tiến hành nhồi lại cột với silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm của Merck. Cột sắc ký được rút khô dung môi sau mỗi phân đoạn thu được. - Đối với mỗi phân đoạn sau khi rửa giải được tiến hành SKBM ứng với hệ dung môi phù hợp để khảo sát chọn phân đoạn cần quan tâm. Kết quả thu được 5 phân đoạn như sau: LE SKC pha thường (n-hexane/acetone) 5/1, v/v LE1 Dịch vàng, trong suốt 5/1, v/v LE2 Dịch xanh đậm, đục 3/1, v/v LE3 Dịch màu đen 1/1, v/v LE4 Dịch màu đen 1/5, v/v LE5 Dịch màu đen Hình 3.4. Sơ đồ cắt lớp từ cao ethyl acetate - Tiến hành SKBM cho 5 phân đoạn trên bằng hệ dung môi CHCl 3/acetone = 20/1, sau đó hiện sắc đồ bằng thuốc thử H 2SO4 10%/ethanol, kết quả các phân đoạn LE1, LE2, LE3, LE4, LE5 được sắp xếp theo thứ tự từ trái qua phải được trình bày trên hình 3.5. 33 LE1 LE2 LE3 LE4 LE5 Hình 3.5. Sắc ký đồ của 5 phân đoạn ứng với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate = 2/1. - Dựa vào sắc ký đồ ở hình 3.5 có thể nhận thấy: các phân đoạn LE2 và LE3 có sắc đồ tương tự nhau và LE4 với LE5 cũng vậy. Do đó, chúng tôi tiến hành gộp phân đoạn: phân đoạn LE1 đổi tên thành LEHA1, gộp 2 phân đoạn LE2 và LE3 lại thành một phân đoạn: LEHA2; đồng thời gộp phân đoạn LE4 và LE5 lại thành phân đoạn LEHA3. Bảng 3.10. Kết quả SKBM các phân đoạn trong cao ethyl acetate STT Phân đoạn Khối lượng cao (g) 1 LEHA1 0,10 2 LEHA2 2,85 3 LEHA3 16,32 Hiện bằng H2SO4 10%/ethanol Nhiều vệt, không tách rõ 3 vệt, tách rõ, có đuôi 4 vệt, tách rõ, kéo dài đến tuyến dung môi Qua khảo sát bằng SKBM với các hệ dung môi tương ứng, chúng tôi nhận thấy rằng, trong 3 phân đoạn được tách từ cao ethyl acetate thì phân đoạn LEHA3 có thể phân lập được cấu tử. Vì vậy công việc của chúng tôi tiếp theo là tiến hành sắc ký cột để phân lập các cấu tử có trong phân đoạn này. 34 KẾT LUẬN Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu thực nghiệm về thành phần hóa học của lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa L.) thu hái tại thành phố Huế, chúng tôi thu được các kết luận như sau: 1. Đã tách được từ lá cây Bằng lăng nước các cao chiết phân đoạn có độ phân cực tăng dần: cao n-hexane có khối lượng m = 50,07g (chiếm 1,76 % hàm khô), cao ethyl acetate có khối lượng m = 99,84 g (chiếm 3,50 % hàm khô), cao n-butanol có khối lượng m = 63,52 g (chiếm 2,23 % hàm khô). 2. Bằng các thuốc thử hóa học đặc trưng đã định tính được các hợp chất có trong các cao chiết: flavonoid, alkaloid, steroid, carotenoid, terpenoid và carbohydrate. 3. Bằng phương pháp GC-MS đã định danh được 17 hợp chất trong cao nhexane (β-sitosterol; vitamin E; squalene,…), 18 hợp chất trong cao ethyl acetate (phenol, 4,4'-(1-methylethylidene)bis-; β-sitosterol, 9-octadecenoic acid, (E)-, …) và 13 hợp chất trong cao n-butanol (1-hexanol, 2-ethyl- ; phenol, 4,4'-(1- methylethylidene)bis-,…). Tổng cộng đã định danh được 36 hợp chất. 4. Bằng phương pháp SKBM và SKC, chúng tôi đã thu được 3 phân đoạn để làm cơ sở cho việc phân lập các chất trong cao ethyl acetate từ lá cây Bằng lăng nước. Trong đó bước đầu có thể chọn phân đoạn LEHA3 để tiếp tục tiến hành sắc ký cột. 35 KIẾN NGHỊ Nếu có điều kiện về thời gian và vật chất để hoàn thiện đề tài này chúng tôi kiến nghị: Tiến hành sắc ký cột để phân lập được các cấu tử có trong cao ethyl acetate của lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa). 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb. Y học, TP. Hồ Chí Minh. [2]. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa, Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. [3]. Lê Trung Hiếu (2011), “Nghiên cứu tách chiết và định lượng hoạt chất polysaccharide vàtriterpenoid trong nấm Linh chiGanodermalucidum”, Luận văn Thạc sĩ Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. [4]. Phạm Hoàng Hộ (1991-1993), Cây cỏ Việt Nam, quyển 2, tập 1, tr. 23-34. [5]. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Duy Tuấn (2012), “Thành phần hóa học của vỏ cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) thuộc chi tử vi (Lagerstroemia)”, Tạp chí khoa học, tr. 184-189, Trường Đại học Cần Thơ. [6]. Lê Hồng Phúc (1971), Điểm qua một số nghiên cứu về chi Lagerstroemia ở Việt Nam, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [7]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb. Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh. [8]. Thái Văn Trừng (1970), Thảm thực vật Việt Nam, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.112, 208-217. [9]. Đoàn Văn Tuấn (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học cành, lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.), PERS.), Họ Lythraceae ở Hà Nội”, Luận văn Thạc sĩ Hóa học Hữu cơ, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. [10]. Đào Hữu Vinh và cộng sự (1985), Các phương pháp sắc ký, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [11]. Trần Vũ, Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh, Trần Hải Bằng (2005), Thực tập phân tích hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Tài liệu tiếng Anh [12]. Talapatra. B. (1983), tetracyclictritecpenoid “Lagerenyl with the 37 acetate and cycloartane lagerenol, skeleton two from Lagerstroemialancasteri”, Phytochemistry, 22, 2559.CA-1984, 100, 171519. [13]. Eric Wei Chiang Chan, Lea Ngar Tan, Siu Kuin Wong (2014), “Phytochemistry and Pharmacology of Lagerstroemia speciosa: A Natural Remedy for Diabetes”, International Journal of Herbal Medicine, pp. 100-105. [14]. Daulatabad C.D., Mulla G.M., Mirajkar A.M. (1991), “Acids from Lagerstroemia thomsoni and Bauhinatomentosa seed oils”, I. Oils. Technol. Asoc. India(Bombay), Vol. 23(3), pp. 53-54. [15]. Zacharias D.E. et al (1963), “Source and structure of lythrin”, Experientia structure of lythrin, 21, 247. CA-1963, 59, 7062. [16].Garcia F. (1941), “Distribution and diterioration of insulin-like principle in Lagerstroemia speciosa (banaba)”. Acta. Med. Philipin., pp. 99-104. [17]. Wright. H. et al. (1971),“Source and synthesis of decinin”, J. Amer. Chem. Soc., 93, 2942. [18]. Phan Minh Giang, Dang Bach Tai, Phan Tong Son (2005), “Flavonoid compounds from the rhizomes of Alpinia gagnepainii K.Schum, (Zingiberaceae)”, Journal of Chemistry, Vol. 43 (1), pp. 105-108. [19]. Phan Minh Giang, Lê Huyen Tran1, Phan Tong Sơn, Hideaki Otsuka (2007), “Chemical constituents of the fruits of Alpinia conchigera Griff. (Zingiberaceae)”, Journal of Chemistry, Vol. 45 (4), pp. 509-512. [20]. Kakuda T., Sakane I., Takihara T., Ozaki Y., Takeuchi H., Kuroyanagi M. (1996), “Hypoglycemic effect of extracts from Lagerstroemia speciosa L. leaves in genetically diabetic KK-AY mice”, Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 60 (2), pp. 204-208. [21]. Chaudhuri P.K. (1984), “Two tetracycline triterpenoids with the cycloartaneskeleton from Lagerstroemia lancasteri”, Phytochemistry, 1987, 26, 3361. CA, 1984, 100, 171519. [22]. Takami K., Iwao. S. (1996), “Hypoglycemic effect of extract from Lagerstroemia speciosa (L) Pers”, Biosci. Biotech. Biochem., Vol. 60 (2), pp. 204-208. [23]. Comins D.L. (1992), “Source and synthesis of subcosin”, J. Oil. Chem., 1992, 57, 5807, CA, 1992, 116, 21289, 83973. 38 [24]. Jehan C.M. et al (1990),“A keto fatty acid from Lagerstroemia speciosa seed oil”, Phytochemistry, 1990, 29, 2323. CA-1990, 113, 148899. [25]. Jansen P.C.M. (1993), “Basic list of species and commodity grouping (Final version). Bogor, Prosea foundation”, Plant resources of South - East Asia , pp. 14-15, 106-107, 274-275. [26]. Della G. M. (1994), “Polyoxygenated oleanane triterpenes from HydrocotylRanunculoides”,Phytochemistry, 1994, 35, 1017.CA, 1994, 120, 245552. [27]. Blomster R.N. (1964), “Isolation of lythrin”. J. Nat. Prod., 1964, 27,15. CA1964, 60, 85123. [28]. Carew D.P. (1962), Chin T.F. “Constituent of Lagerstroemia speciosa (L) Pers.Nature”, 1961, 190, 1108. CA, 1962, 56(1), 3564. [29]. Ferris J.P., Briner R.C., Boyce C.B. (1971), “Lythracese alkaloid”, J. Am. Chem. Soc., 1971, 93(12), 2958-62. CA, 1971, 75(11), 77107. [30]. Sarin L.R., Kapoor L.D. (1961), “Blood sugar levels during sleep in normaland diabetic subjects”, Bull. Reg. Research Lab. Jammu., 1,136. CA1961, 55, 16579. [31]. Amornnat Thuppia, Pornrut Rabintossaporn, Suphaket Saenthaweesuk, Kornkanok Ingkaninan and Seewaboon Sireeratawong (Mar. - Apr. 2009), “The hypoglycemic effect of water extract from leaves of Lagerstroemia speciosa L. in streptozotocin-induced diabetic rats”, Songklanakarin J. Sci. Technol., Vol. 31 (2), pp.133-137. [32]. Nagata. T (1992), “Isolation of epiepoxydon”, Biosci. Biotech. Biochem., 56, 810. [33]. Unno. T., Sakane. I.(1997), “Antioxidative activity of water of Lagerstroemia speciosa (L) Pers. leaves”, Biosci. Biotech. Biochem., 61 (10), 1772- 4. [34]. Barun Kanti Saha, Md. Nurul Huda Bhuiyan, Kishor Mazumder and K.M. Formuzul Haque (2009), “Hypoglycemic activity of Lagerstroemiaspeciosa L. extract on streptozotocin-induced diabetic rat: Underlying mechanism of action”, A Journal of the Bangladesh Pharmacological Society, pp. 79-83. [35]. Osawa. K., Ueda. J. and Takahashi. M. (1974), “Components of the leaves of 39 Lagerstroemia speciosa L.”, Subcostata, L. Indican L. Fauriei. Yakugaku Zassh., 94, 271-3. CA-1974,80,143057. [36]. Jamaludheen. V., Gopikumar. K. and Sudhakara. K. (1995), “Varibility studies in Lagerstroemia”, Indian forester, Vol. 121(2), pp. 137-41. [37]. Katta Vijaykumar, Papolu B. Murthy, Sukala Kannababul, B. Syamasundar and Gottumukkala V. Subbaraju (2006), “Determination of Corosolic acid in Lagerstroemia speciosa Leaves, Extracts and Dosage Forms”, International Journal of Applied Science and Engineerring, pp. 103-114. Tài liệu Internet [38] http://www.baodanang.vn/channel/5433/201308/bang-lang-nuoc-chua-tieuduong-2262457/ updated03/02/2015. [39]http://ucchau.n.dclnh.com/index.php? option=com_content&view=article&id21173Abng-lng-tim-hay-bng-lngnc&catid=17%3Abien-ho&Itemid=36 updated 03/02/2015. [40] http://voer.edu.vn/m/ho-tran-chau/f35b277f updated03/02/2015. . 40