Nội dung

270 Chương 8. NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ VẤN ĐỀ LÀM SẠCH VIRUS Ở THỰC VẬT 8.1. Tầm quan trọng Tạo giống chống chịu các bệnh virus là một hướng nghiên cứu khả quan. Nhưng trong thực tế, chọn tạo giống gặp nhiều khó khăn do thiếu nguồn gen có khả năng chống chịu với các loại bệnh virus khác nhau. Bên cạnh đó, việc tạo giống cây lưu niên còn gặp trở ngại hơn do mất nhiều thời gian và công sức. Gần đây, kỹ thuật gen đã mở ra triển vọng tạo giống miễn dịch di truyền với một số loại virus bằng cách chuyển gen protein vỏ virus hoặc gen iARN vào cây trồng, làm cây có khả năng bất hoạt gen và mARN virus. Tuy nhiên, nhiều vấn đề kỹ thuật và lý luận vẫn còn khá nan giải. Hình 8.1.Các dạng cấu tạo ngoài của virus Do vậy, phương pháp có hiệu quả nhất hiện nay vẫn là tạo ra các vật liệu nhân giống sạch bệnh virus qua nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng hoặc kết hợp với xử lý hoá chất, nhiệt độ. Những phương pháp này đã giúp loại trừ các bệnh virus khác nhau khỏi vật liệu nhân giống và tạo giống sạch bệnh ở một loạt cây trồng, chủ yếu là khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, cây ăn quả có múi, chuối, nho, mơ, mận, cây hoa như cúc, cẩm chướng... Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các bệnh virus, viroid và các tác nhân gây bệnh tương tự virus (Vasil và Thorpe, 1994). Chóp đỉnh sinh trưởng được coi là sạch bệnh virus. Mẫu mô nuôi cấy càng nhỏ và càng gần đỉnh sinh trưởng thì khả năng sạch bệnh càng lớn. Dường như có tương quan tỷ lệ thuận giữa kích thước mẫu với khả năng cây tái sinh sạch bệnh (Stone, 1982; Green và Lo, 1989). Nhưng trong một vài trường hợp, việc loại trừ virus rất khó khăn và không phụ thuộc vào kích thước mẫu do một số virus có khả năng sinh sản và chuyển dịch Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 271 nhanh chóng đến vùng sinh trưởng (Theiley và cs, 1984). Người ta đã quan sát thấy mật độ virus khá cao ở vùng chóp đỉnh sinh trưởng của một số loài dưới kính hiển vi điện tử (Toussaint và cs, 1984). Do vậy, việc kết hợp kỹ thuật nuôi cấy này với các yếu tố kìm hãm virus như hoá chất, nhiệt độ có thể tăng cường khả năng loại trừ bệnh virus và tạo giống sạch bệnh ở cây trồng. Hình 8.2. Cà chua bị bệnh virus đốm vàng Hầu hết các cây trồng nông-lâm nghiệp đều bị nhiễm các hệ thống gây bệnh như nấm, virus, vi khuẩn, mycoplasma và nematodes. Các tác nhân gây bệnh không phải luôn gây chết cây, nhưng nó thường xuyên làm giảm năng suất và chất lượng của cây trồng. Trong khi các tác nhân gây bệnh khác gần như luôn xâm nhiễm vào cơ thể thực vật qua nhân giống sinh dưỡng, thì các bệnh virus lại xuất hiện ở cả những cây trồng nhân giống bằng hạt cũng như nhân giống sinh dưỡng. Mặc dù các cây trồng bị nhiễm bệnh vi khuẩn và nấm có thể phản ứng với việc xử lý các hợp chất diệt khuẩn (bactericidal) và diệt nấm (fungicidal), nhưng người ta chưa thể sản xuất ra các hợp chất thương mại diệt virus để chữa bệnh cho các cây trồng nhiễm virus. Để sản xuất cây sạch bệnh virus, thông thường người ta chọn ra một hoặc nhiều cây khỏe mạnh và sau đó nhân giống chúng bằng phương thức sinh dưỡng, tạo ra một quần thể cây khoẻ mạnh. Nhưng tại nơi mà quần thể của một dòng hoàn toàn bị nhiễm bệnh virus thì chỉ có cách thu được cây sạch bệnh thông qua nuôi cấy mô. Các mô phân sinh đỉnh ở các cây bị nhiễm bệnh thường hoặc là sạch bệnh hoặc chứa nồng độ virus rất thấp. Tuy nhiên, nồng độ của virus trong cây tăng lên tương ứng với việc tăng khoảng cách tính từ các đỉnh phân sinh. Các lý do khác nhau để cho mô phân sinh không hoặc ít bị virus xâm nhiễm là: (a) các virus di chuyển dễ dàng trong cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có, (b) hoạt tính trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào phân sinh ngăn cản sự chép virus, và (c) nồng độ auxin nội sinh cao ở trong các đỉnh chồi có thể ức chế sinh sản của virus. Morel và Martin (1952) đã ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để loại bỏ sự xâm nhiễm virus ở thực vật. Họ nuôi cấy các đỉnh phân sinh tách ra từ cây Dahlia bị nhiễm Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 272 virus và thu được các cây sạch bệnh. Sau đó, các tiến bộ trong loại bỏ virus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Nuôi cấy đỉnh phân sinh cũng cho phép thu được các cây sạch những bệnh khác như bệnh viroid (dạng virus-tác nhân gây bệnh chỉ chứa một đoạn rất ngắn RNA), mycoplasma, vi khuẩn, và nấm. 8.2. Nguyên lý làm sạch virus Danh từ làm sạch virus chỉ đúng về nội dung của công việc. Đó là việc phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus. Ở đây chỉ đề cập tới các cây trồng nhân giống vô tính vì phương thức nhân giống này là nguyên nhân truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác. Vì vậy, biện pháp làm sạch bệnh virus luôn phải kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh. Cả hai biện pháp nằm trong phạm vi phục tráng giống, người ta gọi là biện pháp giữ sạch bệnh. Bên cạnh hai nhiệm vụ là duy trì đặc tính giống và tính đồng đều của giống nhiệm vụ chủ yếu của công tác phục tráng giống là cung cấp được tập đoàn cây bố mẹ và hạt giống sạch virus. Kinh nghiệm thực tế cho hay những biện pháp phục tráng giống có hiệu quả là những biện pháp được thực hiện một cách triệt để và có trách nhiệm. Làm sạch virus được coi là mục tiêu của công tác phục tráng giống. Bên cạnh xử lý nhiệt và xác định tính sạch bệnh, các phương pháp để thu được cây sạch virus bao gồm chủ yếu vẫn là nuôi cấy đỉnh phân sinh. Đương nhiên là kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh ở đây được thực hiện theo một mục đích khác nên phức tạp và tốn kém hơn trong nhân giống vô tính. Vì thế, người ta phân biệt rõ giữa nuôi cấy đỉnh phân sinh trong công tác phục tráng giống nói chung và làm sạch virus nói riêng. Mục đích của công tác bảo vệ thực vật (trong nuôi cấy đỉnh phân sinh và nuôi cấy mô) phân biệt rõ với công tác duy trì giống. Trong công tác bảo vệ thực vật thì yêu cầu lớn nhất là làm sạch virus, nhưng trong thực tế điều đó hầu như không thể đạt được. Vì vậy phải kết hợp nhiều biện pháp để đảm bảo kết quả. Xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh và xác định (thử) virus phải được thực hiện theo một chu trình kín. Các nhà duy trì giống đòi hỏi phải có những cơ thể thực sự sạch virus, để rồi thông qua phương pháp nhân in vitro có thể nhân thành số lượng cây bất kỳ mà không bị tái nhiễm. Các nhà nuôi cấy mô thực vật rất quan tâm đến phương pháp nhân giống in vitro, mà lý do chính là việc làm sạch virus đối với cây trồng. Vì hiệu quả kinh tế, người ta chỉ giới hạn việc nhân giống in vitro ở những cây trồng mà đối với chúng các phương pháp cổ điển để nhân nhanh những giống mới hoặc làm sạch virus không thực hiện được. Phương pháp nhân giống in vitro loại trừ được nguy cơ tái nhiễm và vì thế tỏ ra ưu việt hơn các phương pháp cổ điển. Tuy vậy theo kinh nghiệm thực tiễn, các cây trồng được nhân giống in vitro vẫn còn mang ít nhiều tác nhân gây bệnh. Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 273 Đa số các cây trồng thương mại (commercial crop plants), đặc biệt là các cây nhân giống vô tính đều chứa các virus nội hấp (systemic virus), các virus này ảnh hưởng xấu đến năng suất. Vì vậy, việc sản xuất ra các nguyên liệu thực vật sạch virus hoặc gần sạch virus là rất cần thiết trước khi chúng được nhân giống để đưa ra thị trường. Ở nhiều loài, phương thức cho hiệu quả cao là xử lý nhiệt các cơ quan khác nhau hoặc lúc cây đang sinh trưởng mạnh. Tuy nhiên, đối với một số virus phương thức này hoàn toàn không thích hợp vì thế phải sử dụng một số phương thức khác. Phương thức cho hiệu quả cao nhất là nuôi cấy đỉnh phân sinh, thường có thể kết hợp với xử lý hóa học hoặc xử lý nhiệt. Các phương pháp này cho phép có thể thu được các cá thể không những sạch virus mà còn sạch cả nấm và các nhân tố gây bệnh khác. Từ năm 1952, 1953 Morel và Martin đã thành công trong việc loại trừ một số virus ở khoai tây và thược dược (Dahlia variabilis) bằng cách nuôi cấy đỉnh phân sinh, điều đáng tiếc là các chồi này đã không tạo rễ và người ta phải ghép lên các cây mầm khoẻ mạnh. Tuy nhiên, sau đó trên cơ sở các kết quả của Morel và Martin người ta đã đưa ra nhiều phương pháp sản xuất các cây trồng sạch virus có khả năng tạo rễ ở nhiều loài thực vật khác nhau và các dòng cây đó hiện nay đã được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏ của chồi đỉnh lên môi trường dinh dưỡng thích hợp để chúng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh. Phần mô thường được dùng là vòm phân sinh (meristem dome) cộng thêm cặp lá đầu tiên. Tùy thuộc vào từng loài khác nhau mà đỉnh phân sinh có thể có chiều dài từ 0,1-0,5 mm, một số tác giả yêu cầu chỉ nuôi cấy vòm phân sinh, tuy nhiên một số tác giả lại thu được cây sạch virus từ đỉnh sinh trưởng có chiều dài 0,5 mm. Chồi đỉnh hoặc đỉnh sinh trưởng sau khi cắt thường phải khử trùng bề mặt, nhưng giai đoạn này có thể không cần thiết. Các kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng rất khác nhau tùy thuộc từng loài. Môi trường agar thường không thích hợp cho cây sinh trưởng khi nuôi cấy, chỉ có các “cầu giấy lọc” (filter paper bridge) với phần chân được nhúng trong môi trường lỏng chứa trong ống nghiệm nuôi cấy là thích hợp hơn cả. Chỉ trên các cầu giấy lọc như thế rễ mới phát triển tốt, và cây có thể sẵn sàng để đưa ra đất. Rất nhiều loại môi trường đã được dùng trong nuôi cấy đỉnh phân sinh nhưng không có một môi trường chung thích hợp cho mọi loài. Môi trường chứa các nguyên tố đa lượng và vi lượng của Knop và Berthlot (không có beryllium và titanium), glucose 40 g/L, thiamine 10-5g/L và myoinositol 10-3 g/L ở pH 5,5 có thể được dùng cho nhiều loài. NAA ở nồng độ 10-3 mg/L cần thiết cho sự hình thành các rễ ban đầu, nhưng sau đó phải cấy chuyển sang môi trường không có NAA. Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 274 Các số liệu về điều kiện chiếu sáng và nhiệt độ lý tưởng được công bố rất ít, mặc dù trước đây Hollings (1968) đã đưa ra nhiệt độ nuôi là 20oC dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 22 giờ/ngày. Thời gian để đỉnh phân sinh tạo chồi và rễ là từ vài tuần đến vài tháng tùy loài. Hiện nay, ba biện pháp làm sạch virus tỏ ra có hiệu quả đối với cây lương thực và cây thực phẩm, đó là xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh và chọn lọc bằng các phương pháp thử virus. Mỗi một biện pháp đều thu được kết quả nhất định, nhưng chỉ khi sử dụng một cách tổng hợp cả ba biện pháp người ta mới thu được kết quả sạch virus thực sự. Mức độ hữu hiệu của quá trình làm sạch virus đối với thực tiễn phụ thuộc vào những yếu tố sau: - Khả năng xử lý nhiệt. - Khả năng nuôi cấy đỉnh phân sinh. - Phương pháp thử virus có độ chính xác cao. - Hệ số nhân giống vô tính cây khá cao. - Trồng các vật liệu sạch bệnh ban đầu dưới điều kiện cách ly tốt, tránh được tái nhiễm. - Mức độ (diện tích) trồng trọt cho phép cung cấp đủ cây giống mới trong mỗi năm. Những điều kiện trên đây được thực hiện ở các mức độ rất khác nhau đối với các loài cây trồng khác nhau. Việc làm sạch virus không thể thay bằng việc phân tích virus của một loài cây trồng, phân tích virus cần được thực hiện trước đó và để rồi từ đó mà tìm ra biện pháp thích hợp để bảo đảm cây trồng sạch bệnh. 8.3. Phương pháp làm sạch virus 8.3.1. Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus Không phải tất cả các loài cây sau quá trình xử lý phối hợp nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì đều sạch virus, vì vậy cần phải tiến phải xét nghiệm khoảng thời gian từ lúc tái sinh cây cho tái khi xét nghiệm phải từ 4 đến 6 tháng để các thể virus còn tồn tại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác. Xét nghiệm virus trong khuôn khổ của qui trình làm sạch virus hoàn toàn khác quá trình phân tích virus ở một cây trồng. Đối với việc làm sạch virus thì độ chính xác của phương pháp thử virus trong mỗi loài xét nghiệm mang ý nghĩa quyết định cho nên mỗi một cây cần được xét nghiệm theo nhiều phương pháp khác nhau trong đó cần chú ý tới Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 275 các phương pháp xét nghiệm những loài virus phổ biến và có ý nghĩa kinh tế. Đối với việc phân tích virus một loài cây trồng người ta chỉ chú ý tới số lượng cũng như sự phân loại của chúng. Độ nhạy cảm của mỗi phương pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu, sau đây là một số phương pháp xét nghiệm virus được ứng dụng trong trồng trọt các loài cây hoa: 8.3.1.1. Xét nghiệm bằng cây chỉ thị Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm gây bệnh trên một cây chỉ thị thích hợp hoặc dùng phương pháp ghép có thể chứng minh được bệnh virus. Chỉ sau khi thực hiện phương pháp thử này kết luận về bệnh virus mới thực sự đảm bảo tính chính xác của nó. Phương pháp thử bằng cây chỉ thị luôn được coi là phương pháp xác định đầu tiên và cũng là phương pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc các yếu tố khác nữa. Trong trường hợp xét nghiệm hàng loạt công việc gây bệnh nhân tạo đối với số lượng cây chỉ thị là 10.000 đến 100.000 ở một thời gian nhiều tháng thì độ chính xác của phương pháp giảm đi vì không thể tiến phải các thí nghiệm lặp lại. Tuổi của cây trồng cũng như trạng thái sinh lý của chúng trong các mùa khác nhau của một năm ảnh hưởng rất nhiều đến tính chính xác của phương pháp xét nghiệm. Vì lý do đó, trong trường hợp phải xét nghiệm hàng loạt phương pháp dùng cây chỉ thị không đảm bảo bằng phương pháp miễn dịch. Nếu chỉ xét nghiệm một số lượng cây vừa phải ví dụ 1.000 cá thể thì phương pháp dùng cây chỉ thị không cần thay bằng phương pháp khác vì công việc có thể tiến hành trong một thời vụ thích hợp. Triệu chứng bệnh lý có thể quan sát được sau 3-5 ngày song thông thường là sau hai tháng vì vậy cần một diện tích nhà kính khá rộng trong một thời gian tương đối dài chi phí cho xét nghiệm bằng phương pháp cây chỉ thị thường đắt gấp ba lần so với phương pháp huyết thanh. 8.3.1.2. Phương pháp huyết thanh Tính đặc hiệu cao của phương pháp huyết thanh là một đặc điểm quan trọng. Ngoài ra, phương pháp này còn cho phép xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết quả thu được chậm nhất là sau 48 giờ. Chi phí cho xét nghiệm thấp, để chứng minh virus không cần có nhà kính trồng cây. Phương pháp huyết thanh lại có độ chính xác cao, tuy nhiên người ta chưa sản xuất được kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh rồi cũng chưa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm. Vì rằng với phương pháp này người ta không thể xác minh được đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ, có nhiều phương pháp huyết thanh Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 276 khác nhau đã được ứng dụng trong xét nghiệm hàng loạt đối với cây hoa, trong đó có phương pháp kết tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex, xét nghiệm miễn dịch hướng tâm... Mỗi một phương pháp đều có ưu và nhược điểm đặc trưng thông số về độ chính xác thường thu được với dãy nồng độ dịch ép từ thực vật hoặc virus phân lập. Nhiều nghiên cứu cho thấy không thể coi độ nhạy cảm này thường thu được khi pha loãng dịch ép nhiều lần hoàn toàn cho phép tin tưởng vào kết quả xét nghiệm hàng loạt. Vì thế cần chọn phương pháp thích hợp cho xét nghiệm hàng loạt. 8.3.1.3. Xét nghiệm bằng kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử với sự hoàn chỉnh về kỹ thuật và sau khi ứng dụng phương pháp nhúng có thể đưa vào xét nghiệm hàng loạt với số lượng mẫu vừa phải. Khi chứng minh virus hình đũa và hình sợi ở hoa phong lan và hoa huệ kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt. Khó khăn chủ yếu hiện nay là chi phí cho thiết bị và số lượng mẫu được xét nghiệm bị hạn chế, đồng thời loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cơ quan tử của tế bào thực vật bình thường. 8.3.1.4. Xét nghiệm bằng phương pháp PCR Hiện nay, một phương pháp được sử dụng phổ biến của công nghệ sinh học có rất nhiều tiềm năng ứng dụng đó là khuếch đại gen bằng phản ứng trùng hợp polymerase (polymerase chain reaction) trên máy PCR. Bằng cách thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu của các gen gây bệnh ở virus, người ta có thể khuếch đại các gen này (nếu có) từ DNA hệ gen của thực vật đã được xử lý làm sạch virus. Nếu không xuất hiện sản phẩm PCR đặc trưng của gen virus sau khi phân tích điện di agarose gel thì ta có thể kết luận là cây đã được làm sạch bệnh hoặc ngược lại, cây được xử lý vẫn còn mang virus. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, chính xác và ít tốn kém hơn các phương pháp nói trên. Hiện nay, người ta đã sản xuất một thiết bị phân tích PCR có độ nhạy rất cao gọi là RealtimePCR (PCR thời gian thực hay còn gọi là PCR định lượng) cho phép phân tích với một nồng độ virus vô cùng thấp ở những sinh vật mới bị nhiễm bệnh. Kỹ thuật này đã khắc phục được thời gian chờ đợi virus sinh sản tới một nồng độ đủ cao để đảm bảo độ chính xác của phương pháp xét nghiệm. Phương pháp phân tích PCR đã được ứng dụng rất rộng rãi để chẩn đoán bệnh ở người như sốt xuất huyết Dengue, viêm gan B, viêm gan C, Chlamydia... Và rõ ràng nó rất hữu ích trong việc ứng dụng để xét nghiệm các thực vật bị nhiễm bệnh virus, vi khuẩn hoặc vi nấm... Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 277 8.3.2. Xử lý nhiệt Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làm sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Những cây mía mắc bệnh có thể cho năng suất cao sau khi ngâm ở nước nóng, các nghiên cứu về vấn đề này cho thấy dùng không khí nóng thuận lợi hơn đối với hầu hết cây trồng bởi vì chúng có thể chịu đựng tốt hơn và virus bị loại trừ dần dần. Những hiểu biết của chúng ta về quá trình làm sạch bệnh thông qua xử lý nhiệt còn chưa đầy đủ. Người ta nêu ra giả thiết chung là virus bị ức chế sinh sản ở nhiệt độ từ 34-40oC. Quá trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận vừa được sinh trưởng thường sạch hoặc nghèo virus. Kết quả xử lý nhiệt còn cho thấy cơ thể thực vật có thể được bảo tồn ở trạng thái tối thích trong một thời gian dài ở nhiệt độ cao. Tốt nhất là nên xử lý với chu kỳ quang 16 giờ/ngày. Nhiệt độ phải được kiểm tra liên tục bằng máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lượng nhiệt năng cần thiết, độ ẩm tương đối phải đạt trung bình là 50%. Để đảm bảo sự phân bố nhiệt độ đồng đều trong phòng cần phải có quạt gió. Mỗi một loài cây hoa thường mẫn cảm rất khác nhau đối với nhiệt độ cao trong khi xử lý, ví dụ: hoa cúc có khả năng chịu đựng nhiệt rất lớn: 38oC trong thời gian nửa năm tiếp theo là hoa anh túc. Hoa thủy tiên thì chịu được nhiệt độ 34oC trong thời gian từ 4-6 tuần. Trong một số trường hợp, người ta phải phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc vi ghép để loại trừ bệnh virus (Walkey, 1980; Kartha, 1986; Brown và cs, 1988). Ưu thế của kỹ thuật này là sau khi cây đã qua xử lý nhiệt, mẫu nuôi cấy (hoặc vi ghép) thường có kích thước lớn hơn. Green và Lo (1989) đã tạo giống khoai lang sạch bệnh virus (bệnh vàng lụi) bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kích thước nhỏ (0,3 mm) hoặc o nuôi cấy đỉnh chồi kích thước lớn hơn (1,0 - 2,5 cm) sau khi xử lý cây mẹ ở 37 C trong một đến hai tháng (hình 9). Kết quả tương tự cũng nhận được ở cây sắn (Kartha và Gambong, 1975). Cây mẹ hoặc một phần cây mẹ được xử lý ở nhiệt độ cao bằng cách tăng nhiệt một cách từ từ cho đến khi đạt nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ này có thể ức chế hoặc loại trừ virus khỏi vùng sinh trưởng mạnh nhưng không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây. Cây được lưu giữ ở nhiệt độ tới hạn trong khoảng thời gian xác định, sau đó tách và nuôi cấy chồi đỉnh hoặc sử dụng trong vi ghép. Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn và phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của giống (Converse và Tanne, 1984; Lozoya-Saldana và Merlin -Lara, 1984). Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trường hợp, song đôi khi mô tế bào của cây nhiễm virus nhưng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủng virus vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này (Dawson, 1976). Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 278 Kết hợp xử lý nhiệt độ thấp với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được sử dụng thành công để loại trừ virus khỏi khoai tây và hoa cúc (Paduch-Cichal và Kryczynski, 1987). Bên cạnh đó, người ta sử dụng kết hợp một số hoá chất ức chế virus như ribavirin, vidarabine có gốc adenine để tạo giống sạch bệnh (Cassells và Long, 1980; Stone, 1982). Các hoá chất chống virus thường độc cho mô cây nên ứng dụng của kỹ thuật này vẫn còn hạn chế. Bảng 8.1. Các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy chồi đỉnh của một số cây trồng Môi trường (mg/l) (a) Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 NH4NO3 - - - - - 60 60 - 1650 KNO3 125 125 125 200 125 - - 125 1900 (NH4)2SO4 - - - - 1000 - - - - KCl - - - - 1000 80 80 - - CaCl2.2H2O - 500 500 - - - - - 440 Ca(NO3)2.4H2 O 500 - - 800 500 170 170 500 - 125 125 125 200 125 240 240 125 370 MgSO4.7H2O 125 125 125 200 125 40 40 125 170 KH2PO4 - - - - 1 - - - - FeCl3.6H2O - - - - 5 5 - - - Fe-citrate - 25 - - - - 27,8 25 - Fe(SO4)3 - - - - - - - - FeSO4.7H2O - - - - - - 37,3 - 27,8 5 Na2-EDTA (b) 0,8 (b) - 0,1 - 22,3 1 MnSO4.4H2O (b) 0,04 (b) 0,2 1 0,05 8,6 0,05 37,2 5 ZnSO4.H2O (b) (b) 0,3 - - - NiCl2.6H2O (b) 0,02 5 (b) 1,8 - 0,4 - 0,02 5 22,3 0 MnCl2.H2O (b) - (b) - - - (b) 0,02 5 (b) 0,08 0,03 0,05 0,02 5 8,60 CoCl2.6H2O 0,02 5 0,02 0,02 - CuSO4.5H2O Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 8 9 (c) - 279 (b) - 0,03 - 5 5 (b) 0,02 5 (b) 0,02 - 0,02 - Na2MoO4.2H2 O (b) - (b) - - - - 0,02 5 (b) - (b) - 0,01 - - KI (b) - (b) 2,8 1 0,6 0,02 5 0,02 5 - - H3BO3 0,1 0,25 0,1 - 100 0,1 0,83 - - Myo-inositol 10 10 - 1 10 6,2 0,25 0,25 Capantothenate - 0,02 5 - - - - 0,1 0,83 1 1 5 1 1 10 Inositol 1 0,00 1 0,02 5 1 1 1 - - - Nicotinic acid - - 1 1 1 1 - - Pyridoxine.H Cl - 0,00 1 1 - - - - 1 - 100 0,01 - 0,01 0,01 1 - 0,5 10 - 1 10 - - 0,5 - - 0,1 5 0,01 1 0,1 - - - - 10 - 2,0 1 - - 1 5 - - 0,00 2000 3000 2000 0 0 1000 0 1 0 0,00 - - - 1 - - - 8 - 3000 0 - - - - 4000 0 - AlCl3 (b) H2MoO.H2O Thiamine.HCl Glycine Biotin Cystein Adenine 0,1 - 0,00 1 - - AdSO4 Casein hydrolysate - Glucose - 2000 0 Sucrose - 1 4000 0 Chú thích: Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 0,02 5 6,2