Nội dung

133 Chương 6 Điều chỉnh chu kỳ tế bào Mục tiêu: Sau khi học xong chương này học viên có khả năng: - Giải thích được cơ chế điều chỉnh chu kỳ trên cơ sở gen. - Vẽ được sơ đồ điều chỉnh nhờ phức hợp cyclin- Cdk qua các giai đoạn của chu kỳ. - Trình bày và giải thích được các yếu tố nội bào và ngoại bào tham gia điều chỉnh chu kỳ. 6.1 Điều chỉnh chu kỳ tế bào ở cơ thể đa bào Đối với cơ thể đơn bào thì chu kỳ sống của tế bào cũng là chu kỳ sống của cơ thể và chúng được kiểm soát trực tiếp bởi các yếu tố của môi trường. Đối với cơ thể đa bào tồn tại nhiều chủng quần tế bào soma, mỗi chủng quần được đặc trưng bởi nhịp điệu sinh trưởng và phân bào ổn định, được kiểm soát bởi mối tương quan giữa các tế bào, các mô và cơ thể. Sự ức chế tiếp xúc hay ức chế bề mặt dẫn đến sự kìm hãm qúa trình phân bào. Bình thường tế bào gan không phân bào nhưng gan khi bị cắt bỏ một phần thì ở phần bị cắt bỏ các tế bào gan sẽ phân bào tích cực để bù đắp lại phần cắt bỏ. Có thể là các tế bào chết đã tiết ra một chất có tác động kích thích sự phân bào và sự phân bào diễn ra cho đến khi khối lượng gan đạt tới khối lượng nhất định thì dừng lại. Đó cũng là kiểu điều chỉnh theo cơ chế “liên hệ ngược”. Sự ung thư hóa là sự trục trặc trong cơ chế điều chỉnh phân bào, các tế bào khi bị mất sự ức chế phân bào sẽ phân bào tự do không chịu sự kiểm soát chung và di căn trở thành có hại cho cơ thể. Như vậy, dù là cơ thể đơn bào hay cơ thể đa bào thì chu kỳ sống của chúng đều được điều chỉnh bởi nhiều cơ chế khác nhau. Chúng ta hãy xem xét một số cơ chế cơ điều chỉnh mà di truyền tế bào học phân tử đã làm sáng tỏ. 6.1.1 Một hệ thống trung tâm phát động các qúa trình cần thiết của chu kỳ Để hiểu được cơ chế điều chỉnh của chu kỳ tế bào ta hãy xem xét tế bào như là một chiếc máy giặt quần áo. Chức năng giặt quần áo của máy gồm nhiều công đoạn nối tiếp nhau: lấy nước cùng bột giặt, vò quần áo, xả nước bẩn, vắt khô. Mỗi công đoạn diễn ra trong một thời gian nhất định và nối tiếp nhau. Cũng giống như vậy chu kỳ tế bào cũng gồm nhiều giai đoạn nối tiếp nhau như: sinh trưởng, nhân đôi ADN và phân bào. Mỗi giai đoạn diễn ra trong một thời gian nhất định và nối tiếp nhau. Giai đoạn trước phải được hoàn thành mới có thể tiếp theo giai đoạn sau và điều kiện của giai đoạn sau cũng đã được chuẩn bị trong giai đoạn trước. Trong cả hai trường hợp: chu kỳ tế bào và máy giặt, đều có nhân tố điều chỉnh trung tâm khiến cho các qúa trình xảy ra liên tiếp nhau theo trình tự, theo thời gian trong đó nhân tố điều chỉnh hoạt động như một chiếc đồng hồ qui định nên thời gian hoạt động mỗi qúa trình (giai đoạn) thông qua các điểm chốt (check points). Điểm chốt thể hiện cơ chế điều chỉnh theo mối liên hệ ngược nghĩa là sự hoàn thành qúa trình trước là điều kiện phát động cho qúa trình sau. Tuy nhiên, cơ chế điều chỉnh của chu kỳ tế bào phức tạp hơn nhiều, bởi vì các nhân tố 134 điều chỉnh như chúng ta đã biết là các phức hợp sinh hóa phức tạp hoạt động trong mối tương quan với nhau, với môi trường nội bào và ngoại bào. Hệ thống điều chỉnh chu kỳ tế bào gồm các phức hệ sinh hóa tác động theo chu kỳ và đó là các phức hệ protein hoạt động tương tác và kích thích, phối hợp với các qúa trình tiền thân cần thiết cho sự nhân đôi ADN và phân ly của ADN. Trong chu kỳ hệ thống điều chỉnh đến lượt mình lại được kiểm tra bởi các “phanh” có tác động phanh hãm chu kỳ ở các điểm chốt đặc biệt. Như vậy, khi các qúa trình tiền thân đã hoàn thành là điều kiện cần cho sự khởi động qúa trình tiếp theo của chu kỳ, nhưng cũng có thể bị ách lại ở các điểm chốt. Hệ thống “phanh” rất quan trọng, bởi vì nó cho phép kiểm tra hệ thống điều chỉnh của chu kỳ bởi các tín hiệu đến từ môi trường. Các tín hiệu của môi trường tác động lên hệ thống điều chỉnh bởi hai điểm chốt chủ yếu: một ở giai đoạn G1 ngay trước khi vào giai đoạn S và một điểm chốt ở G2 là điểm mà ở đó hệ thống điều chỉnh thực hiện qúa trình có tác động khởi động sự phân bào ở M. Đối với các tế bào không đi vào phân bào thì chu kỳ bị phanh ngay ở điểm chốt ở G1. Đối với tế bào nấm mem điểm chốt ở G1 thường được gọi là điểm xuất phát - điểm S (start point), còn đối với tế bào động vật điểm chốt này được gọi là điểm hạn định - điểm R (restriction point). 6.1.2 Hệ thống điều chỉnh chu kỳ - phức hệ các protein-kinaza Đã có nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau như: nấm men, tế bào phôi sớm, tế bào động vật có vú, trong nuôi cấy invitro đều chứng minh rằng hệ thống điều chỉnh chu kỳ tế bào là gồm hai họ protein chủ yếu. Họ thứ nhất là các kinaza phụ thuộc cyclin - Cdk (cyclin dependant kinaza) có tác dụng phát động các qúa trình tiền thân bằng cách gây photphorin hóa nhiều protein đặc trưng tại gốc serin và threonin. Họ protein thứ hai là các protein đặc biệt được gọi là cyclin (được gọi như thế vì chúng xuất hiện theo chu kỳ tế bào - cell cycle), các cyclin đóng vai trò kiểm tra hoạt tính photphorin hóa của Cdk đối với các protein đích. Khi cyclin liên kết với Cdk thành một phức hệ thì Cdk ở trạng thái hoạt tính và khi cyclin tách khỏi Cdk thì Cdk không có hoạt tính. Như vậy, bằng cơ chế tổng hợp và phân giải protein cyclin cùng với cơ chế tạo phức hệ và giải thể phức hệ cyclin-Cdk tế bào điều chỉnh chu kỳ sống của mình. Có thể có nhiều loại cyclin khác nhau nhưng người ta xếp chúng vào hai loại chủ yếu là các cyclin mitosis là các cyclin liên kết với Cdk trong giai đoạn G2 và cần thiết để tế bào đi vào mitosis và loại cyclin G1 là các cyclin liên kết với Cdk trong giai đoạn G1 và cần thiết cho tế bào đi vào giai đoạn S. Người ta cho rằng đối với nấm men chỉ có một loại Cdk hoạt động ở cả hai điểm chốt G1 và G2, còn đối với động vật có vú có thể có tối thiểu là hai loại Cdk khác nhau, mỗi loại tác động cho một điểm chốt. Sự hoạt hóa và không hoạt hóa của Cdk trong mỗi giai đoạn của chu kỳ thể hiện sự chuyển giai đoạn của chu kỳ và cũng là thể hiện hiệu quả của hệ điều chỉnh lên chu kỳ bằng cách phát động các phản ứng dẫn tới sự chuyển sang giai đoạn kế tiếp sau đó của chu kỳ. Sự hình thành phức hệ cyclin - Cdk ở G1 cho phép tế bào chuyển từ G1 sang S và sự hình thành phức hệ cyclin - Cdk ở G2 cho phép tế bào chuyển từ G2 sang giai đoạn M. Để hiểu rõ hơn cơ chế điều chỉnh trên đây người ta đã phân tích và lý giải bằng các nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. 135 6.1.3 Chu kỳ của tế bào phôi sớm và vai trò của MPF Đối với các tế bào có chu kỳ chuẩn thì tế bào phải trải qua G1 là giai đoạn sinh trưởng đủ dài mới chuyển sang giai đoạn S để nhân đôi hàm lượng ADN và chỉ sau khi qúa trình nhân đôi ADN hoàn thành thì tế bào mới bước vào giai đoạn G2 và M để phân bào. Như vậy, chu kỳ chuẩn phải kéo dài trong một thời gian đủ dài để hoàn thành các giai đoạn cần thiết trước khi phân bào và hệ thống điều chỉnh của chu kỳ hoạt động thích ứng với thời gian đó. Các tế bào của phôi ở giai đoạn phát triển sớm của nhiều động vật có chu kỳ bất thường. Chúng phân bào rất nhanh và bỏ qua giai đoạn sinh trưởng G1 và như vậy đòi hỏi sự hoạt động của hệ điều chỉnh phải thích ứng với trạng thái đó, nghĩa là cho phép tế bào trong thời gian ngắn nhất phải hoàn thành được các qúa trình tối ưu cần thiết là nhân đôi hệ gen và phân ly hệ gen về hai tế bào con. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng phôi sớm của ếch Châu phi (Xenopus) để xem xét hệ thống điều chỉnh như vậy. Tế bào trứng của ếch là một tế bào rất lớn, đạt đường kính khoảng 1mm, chứa một nhân bé nhưng chứa tế bào chất với khối lượng 100.000 lần nhiều hơn tế bào bình thường, bởi vì trong tế bào chất của trứng chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết đủ cho sự phát triển của trứng đến giai đoạn nòng nọc. Noãn bào (ovocyte - tiền thân của tế bào trứng) sau khi đã qua Meiosis I, trong đó số lượng thể nhiễm sắc đã giảm thành đơn bội (n) và như chúng ta đã biết đặc trưng cho Meiosis là có một lần nhân đôi ADN nhưng trải qua hai lần Meiosis (I và II). Sự sinh trưởng của noãn bào để tích lũy các chất dinh dưỡng trải qua thời gian rất dài, vì vậy tiến trình Meiosis bị ách lại ở pha G2 của chu kỳ chuẩn. Để noãn bào có thể vượt qua điểm chốt để hoàn thành chu kỳ và trở thành trứng chín, đòi hỏi phải có hormon tác động đến noãn bào. Khi trứng được thụ tinh, trứng nhanh chóng phân bào nguyên nhiễm liên tục cho ra một phôi có hàng nghìn tế bào bé mà không cần tăng trưởng và điều kiện cần độc nhất là tổng hợp và nhân đôi ADN qua một chu kỳ. Chu kỳ phân bào đầu tiên kéo dài khoảng 90 phút, nhưng 11 chu kỳ phân bào tiếp theo với khoảng cách chỉ 30 phút và trong khoảng 7 giờ đã hình thành phôi với 212 (4096) tế bào con. Mỗi chu kỳ bao gồm giai đoạn M →15 phút và gian kỳ (interphase - giữa hai lần M) kéo dài 15 phút đủ để nhân đôi ADN, như vậy coi như không có G1 và G2. Nhân tố điều chỉnh có trong tế bào chất kiểm tra cửa đi vào M. Vấn đề đặt ra là tại sao các tế bào phôi sớm lại vượt qua được các điểm chốt dừng G1 và G2 để đi vào M nhanh như vậy? Hai thí nghiệm chủ yếu cho phép người ta giả thiết là có nhân tố tồn tại trong tế bào chất của tất cả các tế bào đang ở trạng thái phân chia và nhân tố đó đã phát động cho tế bào đi vào M. Thí nghiệm thứ nhất sử dụng các noãn bào của ếch đang bị ách lại ở G2 của Meiosis I tức là không đi được vào M. Người ta tiêm tế bào chất của trứng ếch đã chín nhưng chưa thụ tinh vào trong noãn bào đang ở giai đoạn G2 của Meiosis I bị ách lại ở G2, thì noãn bào này sẽ chuyển vào M để tiếp tục hoàn thành phân bào và trở thành tế bào trứng chín. Nhân tố có hoạt tính đó có trong tế bào chất được đặt tên là nhân tố phát động trứng chín - MPF (Muturation Promoting Factor) cũng là nhân tố phát động mitosis hoặc meiosis (Mitosis Promoting Factor - MPF). Bởi vì, nhiều thí nghiệm đã chứng minh chính MPF cũng là nhân tố phát động để tế bào vượt qua điểm chốt G2 để tiến vào M (xem hình 1.7) 136 Hình 6.1 Thí nghiệm tiêm tế bào chất của trứng ếch đã chín có chứa MPF vào noãn bào ếch ở giai đoạn G2 của Meiosis I Loại thí nghiệm thứ hai được tiến hành với các tế bào động vật có vú. Vì tế bào động vật có vú rất bé (từ 10 - 30μm) nên khó sử dụng phương pháp tiêm, cho nên thông thường người ta nuôi cấy invitro chung nhau các tế bào ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ, tạo điều kiện cho chúng hòa hợp lẫn nhau (bằng phương pháp lai tế bào soma). Ví dụ, đem các tế bào đang ở giai đoạn M (giai đoạn phân bào) nuôi chung với tế bào ở giai đoạn G1 hoặc giai đoạn S, hoặc giai đoạn G2 thì các tế bào này (dù ở giai đoạn nào của I → gian kỳ) sẽ đi vào giai đoạn M, thể hiện ở chỗ nhân của chúng có xu thế cô đặc, xoắn ngắn lại giống như thể nhiễm sắc của các tế bào đang ở giai đoạn phân bào. Như vậy, nhân tố MPF không chỉ có tác dụng phát động để vượt qua điểm chốt dừng ở G2 và có thể cũng là nhân tố phát động vượt qua điểm chốt dừng ở G1 cho phép tế bào đi vào S. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng đối với tế bào phôi ếch sớm thì hoạt tính của MPF được tăng cao ở giai đoạn phân bào và giảm bớt ở giai đoạn gian kỳ theo chu kỳ đỉnh cao 30 phút, như vậy hoạt tính phân bào là tùy thuộc vào hoạt tính của MPF. Nhiều thí nghiệm loại bỏ nhân tế bào cũng đã chứng minh được rằng hoạt tính của MPF là đến từ tế bào chất và không phụ thuộc vào sự có hay không của qúa trình nhân đôi ADN trong nhân. Nhưng khi qúa trình tổng hợp protein ở G1 bị ức chế thì hoạt tính của MPF và cả tiến trình phân bào cũng bị ức chế, như vậy hoạt tính của MPF là có liên quan mật thiết đến sự tổng hợp protein đặc trưng trong gian kỳ. Để chứng minh, người ta làm thí nghiệm với phôi sớm của cầu gai, có chu kỳ tế bào giống phôi sớm của ếch. Sử dụng phương pháp đánh dấu bằng phóng xạ (S35 methionin) để theo dõi sự tổng hợp protein qua các chu kỳ tế bào người ta chứng minh rằng một loại protein đặc biệt được tích lũy theo tiến trình của chu kỳ: trong giai đoạn gian kỳ chúng được tích lũy nhiều cho tới giai đoạn phân bào ở bước chuyển trung kỳ - hậu kỳ và sau đó giảm đi đột ngột, vì vậy người ta đặt tên cho loại protein này là cyclin (xem hình 6.2). 137 Hình 6.2 Sự tăng và giảm MPF và Cyclin qua các chu kỳ tế bào phôi ếch sớm Người ta giả thiết rằng có tồn tại một số cyclin, khi hàm lượng của chúng đạt tới ngưỡng nào đó sẽ tác động hoạt hóa MPF và khi chúng bị phân hủy sẽ làm bất hoạt MPF và ức chế phân bào. Để làm sáng tỏ vai trò của cyclin, người ta theo dõi chu kỳ tế bào invitro. Người ta tách chiết tế bào chất của các phôi ếch đang phát triển và cho vào nuôi cấy invitro. Người ta tách nhân của tinh trùng ếch và cho các nhân đó vào môi trường nuôi cấy invitro có tế bào chất của phôi bào. Qua một thời gian các nhân tinh trùng trương phồng và nhân đôi ADN và trong tế bào đã được thụ tinh, người ta có thể dùng phản ứng đó làm chỉ thị để xác định các giai đoạn của chu kỳ tế bào mà từ chúng tế bào chất được chiết xuất và sử dụng. Nếu người ta đem phân hủy hết mARN trong tế bào chất được nuôi cấy invitro thì chu kỳ tế bào bị đình chỉ ở gian kỳ giống như trường hợp có sự ức chế tổng hợp protein ở các phôi bào. Trái lại nếu ta đem cho thêm mARN mã hóa cho cyclin được tinh chế thì hoạt tính MPF được khôi phục và phát động phân bào. Điều đó chứng tỏ rằng hoạt tính của MPF phát động phân bào phụ thuộc vào cyclin được tổng hợp và tích lũy đến một ngưỡng nào đó. Tuy nhiên, hoạt tính của MPF không chỉ phụ thuộc vào cyclin mà còn phụ thuộc vào sự tác động của một số protein khác nữa và cyclin chỉ được xem là một phần của phức hệ, đóng vai trò điều chỉnh hoạt tính của protein kinaza (Cdk) trong phức hệ MPF. Như vậy, sự tích lũy là cần thiết cho sự đi vào mitosis và sự phân hủy đột ngột cyclin là cần thiết cho sự thoát ra khỏi mitosis. Thường thì cyclin bị phân hủy ở mitosis khi chuyển từ trung kỳ sang hậu kỳ. Có nhiều loại (có thể có đến 5 loại) cyclin tác động qua chu kỳ tế bào khi liên kết với Cdk. Như chúng ta đã nêu ở trên, phức hệ MPF gồm hai cấu thành là cyclin đóng vai trò điều chỉnh, cấu thành kia là Cdk (protein kinaza) đóng vai trò là enzym kinaza là phần mang hoạt tính. Cdk sẽ thể hiện hoạt tính photphorin hóa các protein khác cần thiết cho chu kỳ tế bào 138 bao gồm các protein có vai trò làm thể nhiễm sắc co đặc lại, làm phân hủy màng nhân (tác động đến tấm lamina), tạo thoi phân bào v.v.. Một qúa trình quan trọng nhất đòi hỏi phải có đủ thời gian xảy ra trước khi mitosis là sự tái bản ADN phải được hoàn thành, như vậy phải có cơ chế kiểm tra ngược đến từ ADN đang được tái bản nhằm ngăn hệ thống kiểm tra tích cực làm cho tế bào tiến vào M và như vậy ngăn chặn cho tế bào rơi vào tình trạng nguy hiểm “phân bào tự diệt” (vì không đủ lượng ADN để phân cho hai tế bào con). Tuy nhiên, ở phôi ếch sớm trong các chu kỳ tế bào đầu tiên diễn ra trong khoảng 30 phút đầu thì hầu như bỏ qua G1 và G2, như vậy không có tính hiệu kiểm tra ngược. Người ta cho rằng ở đây các điều kiện cho sự tái bản ADN đã có đầy đủ từ môi trường dinh dưỡng trong tế bào trứng, đủ để thực hiện 12 chu kỳ phân bào mà không cần chuẩn bị trước và sau thời gian đó, cơ chế kiểm tra ngược sẽ hoạt động giống như ở chu kỳ tế bào chuẩn. Ngoài ra, còn tồn tại cơ chế kiểm tra tác động ức chế tái bản ADN xảy ra nhiền lần nếu như ADN đó đã được tái bản qua một chu kỳ trước khi vào M 6.1.4 Điều chỉnh chu kỳ tế bào ở nấm men - Các gen mã hóa cyclin và Cdk - Nấm men thuộc giới Nấm (Fungi) là cơ thể đơn bào, đồng thời là đối tượng rất thích hợp trong nghiên cứu di truyền tế bào và sinh học phân tử. Do chúng sinh sản rất nhanh chóng và dễ nuôi trong điều kiện invitro, vì vậy sử dụng chúng để thực hiện các nghiên cứu về di truyền như: xác định, chọn dòng các gen chịu trách nhiệm điều chỉnh chu kỳ tế bào, bởi vì về cơ chế điều chỉnh chu kỳ tuy ít nhiều khác với động vật nhưng cùng có chung nguyên tắc. Hai loài nấm men thường được sử dụng để nghiên cứu về chu kỳ tế bào là nấm mem mọc chồi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men phân đôi (Schizosaccharomyces pombe). Chúng đều tồn tại ở dạng đơn bội hoặc lưỡng bội và có chu kỳ sinh sản vô tính và hữu tính xen kẽ nhau. Khi trong môi trường đủ dinh dưỡng nấm men mọc chồi ở các dạng tế bào lưỡng bội sẽ phân bào nguyên nhiễm (bằng cách mọc chồi con và lớn lên, sau đó tách ra thành hai tế bào) với chu kỳ khoảng 2 giờ. Khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng, các tế bào lưỡng bội sẽ phân bào giảm nhiễm (bằng nảy chồi) cho ra các bào tử đơn bội. Bào tử sẽ nảy mầm thành cơ thể đơn bội và khi điều kiện môi trường thuận lợi chúng có thể phân bào nguyên nhiễm (bằng nẩy chồi) cho ra các tế bào đơn bội hoặc các tế bào đơn bội kết hợp hữu tính ở giai đoạn G1 cho ra tế bào lưỡng bội. Trái lại, nấm men phân đôi thường sinh sản vô tính (phân bào bằng cách phân đôi) ở dạng các tế bào đơn bội khi môi trường thuận lợi, nếu môi trường nghèo chất dinh dưỡng chúng sẽ kết hợp hữu tính cho ra các tế bào lưỡng bội. Các tế bào lưỡng bội nhanh chóng đi vào giảm phân cho ra các bào tử và bào tử sẽ tái sinh thành cơ thể đơn bội khi có điều kiện thuận lợi. Chu kỳ tế bào nấm men kéo dài khoảng 2 giờ và nói chung phức tạp hơn so với chu kỳ tế bào phôi sớm của ếch, bởi vì đối với nấm men cũng như đa số tế bào là cần có thời gian để sinh trưởng trước khi đi vào phân bào nghĩa là chúng cần có giai đoạn G1 và G2 trong chu kỳ. Ở giai đoạn G1 có điểm chốt là điểm S (start) giữ cho tế bào đủ thời gian sinh trưởng và tăng khối lượng gấp đôi cũng như chuẩn bị điều kiện trước khi vào giai đoạn S (tức giai đoạn synthesis-nhân đôi ADN). Trong trường hợp có điểm chốt G2 thì tế bào cần vượt qua chốt này trước khi vào M. Đối với nấm men mọc chồi thì điểm S (điểm chốt G1) là quan trọng nhất vì nó kiểm tra độ sinh trưởng về kích thước tế bào và chịu ảnh hưởng của môi trường. Trong lúc đó, đối với nấm men phân đôi thì điểm chốt G2 lại là quan trọng hơn, nó kiểm soát cửa vào M. 139 - Khi sử dụng nấm men (Schizosaccharomyces pombe) làm thí nghiệm để nghiên cứu chu kỳ tế bào, người ta phát hiện nhiều thể đột biến (mutant) trong đó hai thể đột biến về kiểu hình được quan tâm là thể đột biến cảm nhiệt và có nguồn gốc là do đột biến gen gây nên. Những gen đột biến này gây ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào nấm men phân đôi. Đột biến thứ nhất được gọi là đột biến cdc2 (do gen đột biến cdc2 gây nên) làm cho tế bào to hơn, dài hơn bình thường, vì chúng không phân đôi (không vượt qua điểm chốt G2 vào M). Đột biến thứ hai được gọi là đột biến wee (do gen đột biến wee gây nên) làm cho tế bào bé hơn tế bào bình thường vì tế bào mẹ lớn chưa đủ độ đã phân đôi trở thành tế bào con bé hơn (vượt qua điểm chốt G2 sớm hơn để vào M). Bằng phương pháp di truyền phân tử và công nghệ gen, người ta đã chứng minh được rằng gen đột biến cdc2 và wee là dạng đột biến của gen dại (gen gốc) là cdc2+. Những tế bào nấm men phân đôi dạng dại, tức là dạng bình thường (có chu kỳ tế bào bình thường) sẽ sinh trưởng và phân đôi cho ra các tế bào con có kích thước bình thường. Người ta quy định protein do gen cdc2 mã hóa là protein Cdc2 (với chữ C đầu viết hoa). Nghiên cứu protein này ở các thể đột biến cho thấy trong trường hợp đột biến wee (đột biến bé) hoạt tính của protein Cdc2 rất cao dẫn đến phân bào sớm hơn (tức là vượt qua chốt G2 sớm hơn nên cho ra tế bào con bé hơn bình thường), còn trong trường hợp đột biến cdc2 (đột biến dài) thì không có hoạt tính của protein Cdc2, do đó tế bào bị ách lại không vượt qua điểm chốt G2 nên không phân bào và trở thành dài, lớn hơn bình thường (xem hình 6.3) Hình 6.3 Sơ đồ các gen cdc2 và kiểu hình S.pombe Như vậy, đột biến gen wee là dạng đột biến trội của cdc2 (được ký hiệu là cdc2D) tức là sinh sản ra nhiều protein Cdc2 hơn bình thường, còn đột biến cdc2 là đột biến lặn (được ký hiệu là cdc2-) tức sẽ không sinh sản ra protein Cdc2 (hoặc sinh sản ra Cdc2 không có hoạt tính) và do vậy protein Cdc2 là protein đóng vai trò điều chỉnh chủ chốt trong chu kỳ tế bào từ G2 sang M. Bằng phương pháp thay thế và tái tổ hợp gen, người ta đã chứng minh được rằng Cdc2 là protein kinaza tức là phần hoạt tính của phức hệ MPF. Nghiên cứu trên nấm men S.pombe người ta còn phân lập được gen cdc13+ có vai trò cho phép tế bào đi vào mitosis và gen này mã hóa cho protein tương tự cyclin B ở phôi ếch và cầu gai. Chính cyclin Cdc13 liên kết với Cdc2 để tạo thành phức hệ MPF ở nấm men có tác động để nấm men chuyển chu kỳ tế bào từ G2 sang M. 140 Nghiên cứu trên các thể đột biến của nấm men S.pombe, người ta còn phát hiện ra hai gen khác nữa là gen cdc25 và gen wee1. Gen cdc25 mã hóa cho protein Cdc25 có tác dụng kích hoạt phức hệ MPF, trong lúc đó sản phẩm của gen wee1 là protein Wee1 lại đóng vai trò ức chế hoạt tính của MPF. Như vậy, bản thân phức hệ MPF (Cdc2-Cdc13) chưa có hoạt tính ngay, mà hoạt tính của chúng còn được kiểm tra bởi Cdc25 và Wee1. Nghiên cứu sinh hóa protein cho phép xác định protein Cdc25 của MPF là protein photphataza có tác động giải photpho hợp phần Cdc2 của MPF do đó kích hoạt chúng và Wee1 là protein kinaza có tác động photphorin hóa đối với một kinaza khác CAK. Kinaza CAK đóng vai trò photphorin hóa Cdc2 của MPF. - Như vậy, ở S. pombe tham gia vào sự điều chỉnh hoạt tính của MPF có đến 3 loại protein là Cdc25, Wee1 và CAK. Người ta sơ bộ đưa ra mô hình điều chỉnh hoạt tính của MPF như sau: Khi nồng độ cyclin B (tức Cdc13) đủ sẽ liên kết với Cdk (tức Cdc2) tạo thành phức hệ MPF. Hợp phần Cdc2 trong MPF có thể được photphorin hóa (liên kết với photpho) ở hai vị trí điều chỉnh là vị trí tyrosin15 (Y15) và vị trí threonin161 (T161). Ở trạng thái này MPF vẫn chưa có hoạt tính, chỉ khi vị trí T161 của Cdc2 bị giải photpho (bị lấy mất photpho) do tác động của Cdc25 là một photphataza thì MPF mới trở thành có hoạt tính, nghĩa là có khả năng liên kết với cơ chất tức là protein mà nó cần photphorin hóa. Người ta cho rằng hợp phần cyclin (Cdc13) không chỉ có vai trò cố định Cdc2 mà chúng còn tham gia vào tạo hình liên kết của MPF với cơ chất (xem hình 6.4). Người ta tìm thấy gen đột biến wee sinh sản ra protein kinaza Cdc2 bị sai lệch ở chỗ vị trí tyrosin 15 bị thay thế bởi phenylalanin không thể photphorin hóa dẫn tới tăng cao hoạt tính của Cdc2 và kết quả tế bào vào M sớm hơn cho ra các tế bào có kiểu hình bé hơn (thể đột biến wee). Hình 6.4 Sơ đồ hoạt hóa của phức hệ MPF (Cdc2 + Cdc13) (P) - photphat; Y15-Tyrosin; T161 Threonin; S - bề mặt liên kết - Đối với nấm men mọc chồi S. cervisiae thì điểm chốt quan trọng của chu kỳ là điểm G1, là điểm mà tế bào cần vượt qua để vào S. Để vượt qua điểm S ở nấm men mọc chồi tối thiểu có ba điều kiện quan trọng là kích thước tế bào phải đủ lớn, các chất dinh dưỡng cung cấp đủ và nhu cầu giao phối hữu tính. Nếu tế bào thiếu chất dinh dưỡng thì chúng sẽ dừng lại ở G1 lâu hơn. Và khi tế bào đòi hỏi phải tiếp hợp hữu tính thì chúng cũng dừng lại ở G1 để chuẩn bị tiếp hợp với các tế bào khác để sinh sản hữu tính cho ra tế bào 2n. Khi nghiên cứu các dạng đột biến cảm nhiệt ở S. cervisiae, người ta phát hiện ra các dạng sau: dạng không chồi, dạng có chồi kích thước trung gian và dạng chồi lớn. Các dạng đột biến 141 này đều do đột biến trong gen cdc đặc biệt gây nên. Như ta đã biết ở S.cervisiae người ta quy định kiểu dại được ký hiệu là CDC28, còn gen đột biến lặn là cdc28 và protein do chúng mã hóa được ký hiệu là Cdc28. Gen kiểu dại CDC28 được tách chiết và chúng được dùng để thay thế cho gen đột biến không chồi nghĩa là các thể đột biến không chồi được thay thế bằng gen CDC28 sẽ mọc chồi bình thường và chuyển từ G1 sang S và đi vào phân bào. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen CDC28, kỹ thuật chuyển gen vào E.coli và nghiên cứu protein Cdc28 mã hóa bởi gen CDC28 người ta cho rằng chúng là protein kinaza, chúng có hoạt tính và tương tự Cdc2 ở S. pombe. Bằng thực nghiệm gen CDC28 có thể thay thế cho gen cdcd2− ở thể đột biến của S. pombe. Như vậy, các gen CDC28 và cdc28 ở S.cervisiae đều mã hóa cho protein kinaza phụ thuộc cyclin (tức là cdk) nhưng hai kiểu hình đột biến cảm nhiệt khác nhau: đột biến cdc2− ở S.pombe bị ách lại ở G2, trong lúc đó kiểu hình đột biến cdc28 bị ách lại ở G1. Vì protein Cdk là hợp phần hoạt tính của phức hệ MPF cho nên sai khác trên đây là do hợp phần điều chỉmh tức là protein cyclin của MPF. Phức hợp MPF ở S. pombe tác động ở G2 là do Cdc2cyclin B (cyclin của G2) còn đối với S. cervisiae người ta đã giả thiết là có phức hệ SPF (SPhase Promoting Factor) bao gồm hai hợp phần là Cdc28 và cyclin của G1 tác động trong giai đoạn G1. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra 3 gen mã hóa cho các cyclin của G1 là các gen CLN1, CLN2, và CLN3. Khi giải trình tự các gen này người ta thấy chúng mã hóa cho các cyclin thân thuộc. Mỗi một protein Cln (cyclin G1) đều có vùng chứa khoảng 100 gốc axit amin tương đồng với cyclin của mitosis ở cầu gai, ở S. pombe và ở người. Những thí nghiệm loại bỏ gen (gene knockout) đã chứng minh rằng các tế bào của S. cervisiae có thể sinh trưởng trong môi trường giàu chất dinh dưỡng nếu như chúng mang một trong ba gen CLN. Nếu cả ba gen đó bị loại bỏ thì chúng sẽ chết và khi loại bỏ gen cln3 giai đoạn G1 sẽ kéo dài thêm vài giờ. Như vậy, phức hệ SPF bao gồm protein Cdc28 và ba dạng cyclin (cln1, cln2, cln3) là phức hệ có hoạt tính kinaza cần thiết cho giai đoạn G1 chuyển sang giai đoạn S đối với S. cervisiae, trong đó có cyclin cln nào đó sẽ làm giảm tỷ lệ số tế bào ở lại giai đoạn G1 và khi hàm lượng Cdc28-cyclin G1 được tăng cao sẽ làm cho tế bào vượt qua điểm chốt S sớm hơn để vào giai đoạn S. Trong lúc đó nếu thiếu bất kỳ dạng Cln nào đó thì tế bào đều bị ách lại ở G1, chứng tỏ Cdc28-cyclin G1 (tức phức hệ SPF) là cần thiết cho tế bào nấm men đi vào giai đoạn S. Đối với nấm men dạng cyclin Cln3 được biểu hiện suốt cả chu kỳ với mức độ gần như ổn định, trong lúc đó cyclin Cln1 và Cln2 được biểu hiện ở nửa sau của giai đoạn G1 và khi hàm lượng của chúng tăng cao nhanh chóng cho đến tối đa khi tế bào đã vượt qua điểm chốt của G1 để vào S sau đó hàm lượng của chúng giảm dần và bị giảm tối thiểu ở giai đoạn mitosis. Người ta chứng minh rằng Cdc28-Cln1 và Cdc28-Cln2 có vai trò photphorin hóa APC (phức hệ phát động hậu kỳ - Anaphase Promoting Complex) là bất động chúng, cho phép tích lũy các cyclin clb5-Clb6 ở cuối G1. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng hoạt tính của Cdc28-Cln3 có tách động lên kích thước tế bào thông qua cơ chế điều chỉnh mà hiện nay chưa được biết rõ. Khi được hoạt hóa Cdc28-Cln3 sẽ photphorin hóa và làm hoạt hóa hai nhân tố phiên mã là SBF và MBE và dẫn đến phiên mã các gen CLN1 và CLN2 và một số gen mã hóa cho các đơn vị bé của ADNpolimeraza, RPA, ADN ligaza và các enzym cần thiết cho sự tổng hợp triphotphat deoxyribonucleosit. 142 Ngoài ra người ta còn tìm thấy ở nấm men S. cervisiae hai gen mã hóa cho dạng cyclin B là CLB5 và CLB6, hai gen này mã hóa cho cyclin Clb5 và Clb6 và được biểu hiện ở cuối G1. Các phức hệ Cdc28-Clb5 và Cdc28-Clb6 được tích lũy ở cuối G1 và bị bất hoạt do chúng liên kết với một nhân tố ức chế là Sic1. Sic1 có mặt ở cuối mitosis và đầu G1. Sic1 đóng vai trò là nhân tố ức chế giai đoạn S, đặc biệt là ức chế phức hệ Cdc28-cyclin B nhưng không có tác động với phức hệ Cdc28-Cln. Khi tế bào vào giai đoạn S và khi nhân tố ức chế Sic1 bị phân giải thì phức hệ Cdc28-Clb5 và Cdc28-Clb6 trở nên có hoạt tính và phát động sự tái bản ADN. (hình 6.8). Nhân tố ức chế Sic1 bị phân giải bởi proteasome bằng con đường ubiquitin hóa bởi các enzym Cdc34 và SCF (hình 6.5). Vào thời gian cuối giai đoạn S có sự phiên mã của 2 gen mã hóa cho dạng cyclin B là Clb3 và Clb4 và chúng liên kết với Cdc28 tạo thành phức hệ kinaza Cdc28-Clb3 và Cdc28Clb4 có vai trò phối hợp với Cdc28-Clb5 và Cdc28-Clb6 duy trì sự tái bản ADN, nhưng đồng thời chúng có vai trò phát động sự tạo thành thoi phân bào khi bắt đầu mitosis. Hình 6.5 Cơ chế kiểm tra G1---> S ở S. cerevisiae Khi sự tái bản ADN kết thúc và tế bào đi vào G2 còn có hai dạng cyclin B được biểu hiện là Clb1 và Clb2 đóng vai trò là cyclin của M. Chúng liên kết với Cdc28 tạo thành phức hệ cần thiết cho sự phân ly của thể nhiễm sắc và phân đôi nhân ở M. Như vậy, các nghiên cứu ở nấm men S. cerevisiae đã chứng tỏ có nhiều nhóm cyclin định hướng cho kinaza Cdc28 hoạt động với các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào. Ba dạng cyclin hoạt động trong G1 là Cln1, Cln2 và Cln3. Hàm lượng của Cln3 giữ ở mức ổn định suốt chu kỳ nhưng hoạt tính của chúng bị kiểm tra bởi kích thước tế bào. Khi cdc2-Cln3 hoạt động, chúng photphorin hóa hai nhân tố phiên mã dẫn đến sự hình thành ở cuối G1 các cyclin Cln1 và Cln2, các enzym và các protein khác cần thiết cho sự tái bản ADN, cũng như sự hình thành Clb5 và Clb6 ở cuối G1. Các cyclin Cln1 và Cln2 tạo phức hệ với Cdc28 có vai trò ức chế phức hệ APC, do đó cho phép tích lũy Clb5 và Clb6 ở cuối G1. Phức hệ Cdc28-Clb5 và Cdc28-Clb6 xuất hiện ở cuối G1 lúc đầu bị ức chế bởi Sic1. Sic1