Nội dung

CHƯƠNG 5 DI TRUYỀN VI SINH VẬT Mục tiêu 1. Trình bày được các kiểu đột biến và cơ chế của các tác nhân gây đột biến 2. Phân biệt được 2 loại tái tổ hợp di truyền và 3 loại nhân tố di truyên IS, Tn và Bacteriophage Mu 3. Trình bày được phương pháp vận chuyển vật liệu di truyền ở vi khuẩn. 4. Trình bày các bước cơ bản và lợi ích của kỹ thuật di truyền trong công nghiệp. 1. Đại cương Các VSV hầu hết đều giống tổ tiên của mình ở hầu hết các đặc điểm. Di truyền là việc duy trì các đặc điểm của tổ tiên cho đời sau của thế giới hữu sinh . Đơn vị di truyền là gen. Gen là một đoạn ADN đảm nhiệm việc mã hoá một đơn vị tính trạng di truyền, các đặc điểm của gen được di truyền cho thế hệ sau qua sao chép. Phần lớn gen nằm trong nhân tế bào. Phần nhỏ thuộc plasmid, các yếu tố di truyền động. 1. §¹i c­¬ng * Theo quan niÖm hiÖn hµnh dßng th«ng tin di truyÒn tõ nhiÔm s¾c thÓ ®Õn tÕ bµo chÊt ë mäi vi sinh vËt diÔn ra nh­sau: 1 2a 1 3a ADN ARN protein  2b 3b? * LiÖu qu¸ tr×nh 3b cã tån t¹i trong tù nhiªn hay kh«ng? : NH2 OH N N N N N H H2N N Adenin OH Uracil Guanin NH2 CH3 N N N H OH N HO N HO N T hymin N HO N Cit osin NH2 NH2 N N N HOH2C N N N O H N HOH2C H H OH H H H O H OH Nucleozid cña ADN O - P O N N H OH NH2 N - H Nucleozid cña ARN NH2 O N N N O 5' O CH2 O 1' 4' H H H H 3' 2' OH H Nucleotid cña ADN O - P O N N - N 5' O CH2 O 1' 4' H H H H 3' 2' OH OH Nucleotid cña ARN 2. Sao chép AND, phiên mã, dịch mã ( Sinh viên tự nghiên cứu ) 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN 3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo 3.1.1. Đột biến ngẫu nhiên + Nguyên nhân: * Tác động của môi trường * Chuyển hóa tautomer (hỗ biến của các base khi sao chép) + Ví dụ: T ở dạng keto khi sao chép chuyển sang dạng enol sẽ bắt cặp với G . Hậu quả là trong sợi ADN mới sau 1 thế hệ 1 cặp GC sẽ thay vào vị trí AT 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN 3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo 3.1.1. Đột biến gây tạo + Nguyên nhân: Sử lý TB VSV với các tác nhân gây đột biến vật lý, hóa học, sinh học + 2 dạng đột biến: - Đột biến tổng gen thay đổi số genom của VSV VD: từ đơn bội thành đa bội => có giá trị trong cải tạo giống - Đột biến gen thay đổi cấu trúc gen gồm + Đột biến điểm + Đột biến trượt khung 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN VÀ CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN 3.1. Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo + Đột biến điểm một cặp base bị thay thế bằng một cặp base khác - Chuyển dịch (base purin được thay bằng purin) VD: AT thay bằng GC - Đảo dịch là khi base purin được thay thế bằng base pirimidin VD: AT thay bằng CG + Đột biến trượt khung ( 1 đoạn ADN bị loại đi, bị chuyển chỗ , bị cách ra do sự chèn vào của ADN lạ ) Đột biến điểm đổi cặp base A-T Tác nhân đột biến Cặp base AT dưới tác dụng của tác nhân đột biến đã biến thành cặp GC trong allen đột biến . (H)A*- T (H)A* - C (H)A*- C A-T G-C Đột biến trượt khung C C G CT TT T C G AT GGC GA A A A GC T A ®øt ®o¹n C C G C T T T TC G A T GGC G A A A GC T A A T¸i tæng Sãng ®«i sai hî p ADNligase C C GC T T T T C GA T GGC GA A A A GC T A A Thªm A C C GC T T T T C GA T GGC GA A GC T A T¸i tæng hî p ADNligase Ph© n huû TT C C G C T T C GA T GGC G A A GC T A Tr­ î t khung thay ®æi m· (c¸c acid amin thay ®æi trong protein) MÊt A A 3.2. Cơ chế td của các tác nhân đột biến 3.2.1. Lắp chất tương tự base Chất tương tự base là chất kháng trao đổi (anti – metabolite), tế bào nhầm lẫn lắp vào ADN. Thường gây đột biến là BU (5 bromuracil) và AP (2-amino-purin) 3.2.1.LẮP CHẤT TƯƠNG TỰ BASE A A Nhân đôi 5BU Nhân đôi G Nhân đôi T G 5BU C Quan sát sơ đồ và mô tả cơ chế phát sinh đột biến gen do tác động của 5BU (5Brôm – Uraxin). 3.2.2. Thay đổi hóa học của base + Acid nitrơ khử amin của A, G, nhưng không làm đứt sợi, do đó thay thế nhóm –NH2 bằng -OH: => A thành hypoxantin ghép đôi được C AT => GC => G thành xantin, vẫn sóng đôi với C nên không gây đột biến + Hydroxylamin pứ chủ yếu với C, khiến base này sóng đôi sai với A, CG => TA +Ethyl- và methyl-sulfonat, ethylenimin, Nnitroso-guanidin là các tác nhân alkyl hóa gây đột biến mạnh Đột biến gây tạo do hydroxylamino H H N H H NH2OH H N N dr O Cytosin OH H - H N N + N H H N dr N N N O Hydroxylamino-cytosin H N H Adenin dr 3.2.3.Chèn thêm vào hoặc loại đi một cặp base. Phân tử acridin xen vào giữa các cặp base trên chuỗi ADN làm tăng khoảng cách giữa chúng => mất đi một số cặp hoặc thêm vào một số cặp base và như vậy làm chuyển dịch khung đọc mã trong tổng hợp protein gây đột biến. Tác dụng gây đột biến của Acridin Sî i mí i Sî i khu«n Acridin 6 5 4 3 2 1 6' 5' 4' x' 3' 2' 1' 0,68 nm x'-ngÉu nhiªn xen vµo Sao chÐp ADN 6 5 4 x 3 2 1 6' 5' 4' x' 3' 2' 1' CÆ p x - x' ® ­ î c xen vµo 3.2.4. Ánh sáng tử ngoại UV và bức xạ ion hóa Ánh sáng tử ngoại UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion khác nhau có tác dụng gây chết mạnh và gây đột biến. Ánh sáng UV tác dụng lên acid nucleic hậu quả là khi sao chép bị sai lệch. Ví dụ: ánh sáng tử ngoại gây đột biến đổi dịch, trượt khung thậm trí mất đoạn. Tia Rơnghen, alpha, beta, cũng là 1 tác nhân gây đột biến. Ánh sáng tử ngoại UV : * Năng lượng thấp không đủ để ion hóa, không xuyên xâu nên không tác động được vào các tế bào nằm sau trong cơ thể sinh vật. Có hiệu quả đột biến ở VSV, hạt phấn… * Cơ chế chủ yếu của đột biến UV là do acid nucleic và các hợp chất trong tế bào hấp thụ, sự hấp thụ càng mạnh thì khả năng đột biến càng cao. * Acid nucleic hấp thụ bước sóng 260 nm là cao nhất , nên bước sóng 260 nm có hiệu quả đột biến tốt nhất. Tác dụng của UV (ĐB gen or ĐB NST): + Các base thymin gần nhau trên phân tử ADN liên kết với nhau tạo dimerthymin,gây méo mó phân tử ADN có thể dẫn đến mất khả năng tái bản của ADN. + Tia UV thường ít gây chết tế bào mà tạo nên các đột biến. Tác động gây đột biến phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào, tuổi giống, loài sinh vật… Tia - bức xạ ion hóa Tia có bản chất sóng điện từ với bước sóng cực ngắn gồm tia X, tia gamma. Tia có bản chất hạt gồm các tía alpha, beta, các proton,… Các tia bức xạ có năng lượng lớn làm cho các phân tử nước và các phân tử trong tế bào bị phá vỡ thành những phân tử tích điện ( bị ion hóa). Khi có mặt O2 bức xạ oxi hóa sinh ra các peroxid hydro và nhiều chất phản ứng mạnh gây tổn thương ADN. 4. TÁI TỔ HỢP DI TRUYỀN VÀ CHUYỂN TÍNH TRẠNG 4.1. Tái tổ hợp di truyền + Tái tổ hợp của tế bào nhân thật: Hợp tử là sản phẩm kết hợp của 2 tế bào + Tái tổ hợp ở tế bào nhân nguyên thủy * Một phần của ADN của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận do đó chỉ xuất hiện hợp tử 1 phần. Đoạn ADN của tế bào nhận và ADN của tế bào cho ,sóng đôi và trao đổi đoạn và khi phân bào tiếp theo sẽ xuất hiện 1 tế bào chỉ chứa NST đã tái tổ hợp. * Tái tổ hợp di truyền gồm có: - Tái tổ hợp phổ biến - Tái tổ hợp đặc hiệu 4.1.1.TÁI TỔ HỢP PHỔ BIẾN TH phổ biến là quá trình mà trong đó ADN lạ mới xâm nhập vào trong tế bào được liên kết với ADN chủ thông qua việc ghép đôi đoạn tương đồng ,bẻ vỡ và trao đổi chéo 2 đoạn ADN có trình tự giống nhau Có 6 enzym tham gia vào quá trình này: trong đó đáng chú ý là -SSB protein, RecA protein ADN tế bào nhận ADN của tế bào nhận tái tổ hợp , 4.1.1.TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU phage Lambda ATTP gal Lambda bio gal ATTB bio ADN E. coli gal ADN E. coli bio ADN E. coli t¸i tæhî p AND của E.coli tái tổ hợp 4.1.1.TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU Tái tổ hợp đặc hiệu vị trí chỉ cần một đoạn ADN tương đồng rất nhỏ để nhận biết – gọi là trình tự nhận biết, quá trình này cần các enzym đặc hiệu cho các phân tử ADN tái tổ hợp. Phân loại: + Tái tổ hợp đặc hiệu 1 vị trí: 1 phân tử ADN mang trình tự nhận biết + Tái tổ hợp đặc hiệu 2 vị trí nếu cả 2 phân tử ADN đều mang trình tự nhận biết. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động 4.1.3.1. Nhân tố chèn vào IS IS là nhân tố di truyền có thể lắp vào các vị trí khác nhau trên genom của vi khuẩn làm mất tính liên tục của gen. Đặc tính này tạo cho IS có khả năng di động rộng rãi. Nhân tố IS được xác định đầu tiên là ở E.coli gồm 800 -1400 cặp base và không mang một phenotyp nào khác ngoài chức năng chuyển chỗ. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động 4.1.3.1. Nhân tố chèn vào IS IS được phát hiện đầu tiên ở E.coli do tác động ức chế hoạt động của gen. Khi IS xen vào bên trong gen tương ứng VK mất khả năng lên men galactose, khi nhân tố này rời khỏi gen khả năng lên men galactose được tái lập. Các trình tự IS không mã hóa protein nên chỉ có thể phát hiện chúng thông qua tác động của chúng. 4.1.3. Các nhân tố di truyền động 4.1.3.2. Transposon (Tn) Là nhân tố di truyền động gây đột biến và được gọi là ‘gen nhảy’. Tn đọc mã một số tính trạng dễ nhận thấy về kiểu hình như tính kháng kháng sinh (penicilin, tetracyclin, kanamycin…), tính kháng kim loại nặng như Ag. Sự chuyển chỗ của Tn là kết quả của sự sao chép do đó không làm mất đi Tn ở vị trí chèn vào ban đầu trong ADN. 4.1.3.3. Bacteriophage Mu *Có chung đặc tính của cả IS và Tn. Bacteriophage Mu coi như 1 Tn khổng lồ, khi hợp nhất vào tế bào chủ sẽ gây đột biến. * Đảo ngược gen là đặc tính đáng chú ý của bacteriophage Mu. * VD: Sù ®¶o ng­îc ®Çu ®o¹n G cña Bacteriophage Mu. §o¹n G m· ho¸ tæng hîp c¸c protein sîi ®u«i. NÕu ®o¹n n»y n»m theo h­íng G+, c¸c protein ®u«i S vµ U ®­îc t¹o thµnh vµ phage nhiÔm vµo E. coli K 12. NÕu ®o¹n ®¶o ng­ îc theo h­íng G-, mét promotor kh¸c sÏ ho¹t ®éng vµ sîi ADN ®èi diÖn sÏ ®­îc sö dông, sîi nµy phiªn m· c¸c gen kh¸c mµ s¶n phÈm cña chóng lµ mét protein ®u«i S’ vµ U’ kh¸c lµm thay ®æi phæ vËt chñ cña phage. Nhê vËy phage cã thÓ hÊp thô vµo c¸c tÕ bµo E. coli C vµ c¸c vi khuÈn ®­ êng ruét kh¸c. Sù ®¶o ng­îc còng liªn quan ®Õn Salmonella, vµ ë ®©y liªn quan ®Õn sù thay ®æi tæng hîp tiªn mao cña vi khuÈn. 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Đ/n: Sự chuyển gen ADN được giải từ một vi khuẩn cho hoặc được chiết từ vi khuẩn cho này sang vi khuẩn nhận khác gọi là biến nạp. Các tế bào ở trạng thái có thể biến nạp được bởi 1 ADN trong môi trường là các tế bào khả nạp. Phân loại: - Biến nạp tự nhiên : Trạng thái khả nạp do các gen NST mã hóa và được kích thích bởi một số điều kiện của môi trường. - Biến nạp nhân tạo: Trạng thái khả nạp có được phải qua xử lý nhân tạo. Ví dụ ủ với nồng độ cao các ion hóa trị 2. 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Tính trạng biến nạp tự nhiên thường là tính kháng độc tố và tính nguyên dưỡng với acid amin. Trong trạng thái sinh lý thích hợp tế bào khả nạp có bề mặt tế bào thay đổi, thành tế bào xốp có hoạt tính enzym ngoại bào cao, đồng thời yếu tố khả nạp đã được tạo ra và tiết vào môi trường. Nồng độ ADN thích hợp cho biến nạp chỉ cần thấp: 0,1 µgADN/ml huyền dịch tế bào là đủ để biến nạp 5 % quần thể tế bào nhận. Thí nghiệm Grififth với D.pneumoniae (nòi S,R) 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) VD: Diplococcus pneumoniae Điều kiện: - 12 phân tử Protein nhỏ được tổng hợp tiết vào môi trường - Nồng độ của TB và các yếu tố khả nạp đạt đến nồng độ nhất định. => Màng của thành TB chứa cấu trúc dạng túi bên trong mỗi túi có protein liên kết đặc hiệu với 1 trình tự AND gồm 11 cặp base. 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Streptococcus pneumoniae Hấp thụ và chế biến ADN từ bất kỳ nguồn nào chẳng hạn ADN từ tinh trùng cá hồi hay từ S.pneumoniae khác đều được hấp thụ như nhau. Tuy nhiên chỉ có ADN tương đồng với ADN của vi khuẩn nhận mới được hợp nhất, 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp tự nhiên (Khả nạp tự nhiên ) Haemophilus influenza Hấp thụ plasmid nguyên vẹn nếu plasmid chứa 11 thứ tự base phù hợp Còn S.pneumoniae bao giờ cũng cắt plasmid khi xâm nhập vào tế bào và chuyển thành sợi đơn. 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Đối với các VK ở điều kiện bình thường không có khả năng biến nạp, tính khả nạp có thể được cảm biến ứng nhờ xử lý tế bào với dung dịch CaCl2 hoặc ủ ở nhiệt độ lạnh. VD: Việc sử dụng các VK Gr (+) chi bacillus và các xạ khuẩn chi Streptomyces việc sử dụng nguyên sinh chất thiếu vách (tế bào trần) để biến nạp có ý nghĩa thực tiễn cao….(SGT) 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ màng. Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện 4.2.BIẾN NẠP (transformation) Biến nạp nhân tạo (Khả nạp nhân tạo ) Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng tế bào chất 4.3.TẢI NẠP (transduction) Đ/n: Tải nạp là sự chuyển gen ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ phage Thường chỉ một đoạn ngắn ADN được chuyển Có - Tải nạp phổ biến - Tải nạp đặc hiệu Và trong cả hai trường hợp phage tải nạp thường bị khuyết tật như mất khả năng dung giải tế bào chủ Tải nạp thường gặp ở các loài Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella..Tuy nhiên không phải tất cả các tất cả các phage đều có thể tải nạp và các vi khuẩn đều tải nạp được. 4.3.TẢI NẠP (transduction) 4.3.1. Tải nạp không đặc hiệu Đ/n: Là kiểu tải nạp mà trong đó một đoạn bất kỳ của ADN tế bào chủ được lắp thêm hoặc được thay thế bằng genom của phage. Thí nghiệm - Chủng S.typhimurium B+ được nhiễm phage ôn hòa P22 - Sau khi dung giải tế bào chủ các phage được tách riêng và ủ với chủng S.typhimurium B( khác với S.typhimurium B+ ít nhất một tính trạng di truyền) - Kết quả: Khi nuôi cấy S.typhimurium B- xuất hiện một số biến chủng có tính trạng của S.typhimurium B+ 4.3.TẢI NẠP (transduction) 4.3.1. Tải nạp không đặc hiệu Đối với phage 22 của Salmonella, phage P1 của E.coli chỉ một tính trạng hoặc là các gen rất gần nhau là có thể được tải nạp. Đoạn ADN được tải nạp chỉ bằng 1-2% ADN của vi khuẩn Phage PBS1 của B.subtilis tải nạp được 8% genom của TB chủ Quá trình tải nạp nhờ phage Chu trình nhân lên của phage 4.3.TẢI NẠP (transduction) 4.3.2. Tải nạp đặc biệt • • Chỉ một đoạn ADN nhỏ xác định được tải nạp mà thôi.Chẳng hạn là phage lamda thường chỉ tải nạp gen gal và gen bio. VD: Phage tải nạp nhiễm vào 1 tế bào nhận bị khuyết tật chẳng hạn gen gal (-), tái tổ hợp qua trao đổi gen gal (-) bằng tải nạp gal (+). Các thể tái tổ hợp hoặc các thể tải nạp tạo thành sẽ là gal (+). 4.3.TẢI NẠP (transduction) 4.3.2. Tải nạp đặc biệt Phage phi 80 : lắp vào cạnh gen đọc mã tổng hợp triptopan do dó thích hợp cho việc chuyển các gen trp. • Một số trường hợp ADN được tải nạp không tái tổ hợp mà nằm ngoài NST của thể nhận: =>”tế bào dị hợp về tính trạng được truyền tải”ADN được phiên mã nhưng không sao chép. => “Tải nạp khuyết” • 4.3.3. Tiếp hợp ( conjugation) Đ/n: Tiếp hợp là sự vận chuyển ADN qua thiết lập cầu tiếp hợp trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn, sự dịch chuyển này được định hướng từ tế bào cho (đực) sang tế bào nhận (cái). Tế bào cho chứa một yếu tố ADN có thể di chuyển được gọi là plasmid giới tính F. Những TB thiếu plasmid F (F-) chỉ có thể là thể nhận Khi tiếp hợp 100% plasmid được chuyển nhưng không có tính trạng nào của nhiễm sắc thể được hợp chuyển. 4.3.3. Tiếp hợp ( conjugation) Plasmid có thể hợp nhất vào nhiễm sắc thể và khi tiếp hợp ADN của nhiễm sắc thể sẽ được chuyển từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận với tần số cao hơn hàng trăm lần so với dùng chủng F+ => Tế bào Hfr (tần số cao của các thể tái tổ hợp) Plasmid F gắn vào NST theo kiểu thuận nghịch và khi tách ra nếu không chính xác nó sẽ kéo theo 1 đoạn ADN của tế bào chủ tạo plasmid F’ Tiếp hợp 4.4.VAI TRÒ CỦA CÁC PLASMID TRONG SINH HỌC Plasmid là phân tử ADN sợi kép, vòng kín, kích thước 105 base có khả năng tự sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. C¸c tÝnh tr¹ng ®­îc m· ho¸ bëi plasmid th­êng cung cÊp cho c¸c tÕ bµo chñ c¸c ­u thÕ sinh tr­ëng, vµ nhê ®ã mµ c¸c tb nµy thu ®­îc ­u thÕ chän läc. Vai trò của các plasmid trong sinh học Vai trò của các plasmid trong sinh học + Plasmid kháng thuốc + Plasmid mã hóa bacteriocin + Plasmid mã hóa yếu tố gây bệnh + Plasmid mã hóa trao đổi chất phức tạp 4.4.1. Plasmid kh¸ng Plasmid R (plasmid kh¸ng thuèc) … Kh¸ng víi kim lo¹i nÆng, nh­b¹c, nicken, C¸c plasmid R cã thÓ ®­îc chuyÓn t¶i nhê tiÕp hîp hoÆc biÕn n¹p. Mét sè gen nhiÔm s¾c thÓ còng ®­îc huy ®éng bëi plasmid R. 4.4.2. Plasmid m· ho¸ bacteriocin Mét sè protein cã kh¶ n¨ng giÕt chÕt hoÆc k×m h·m sinh tr­ëng cña c¸c loµi th©n thuéc, lµ c¸c bacteriocin vµ do plasmid m· ho¸: Colixin, pyoxin, megaxin. 4.4.3. Plasmid m· hãa yÕu tè g©y bÖnh C¸c yÕu tè x©m thùc – invasin (S. flexneri ), Enterotoxin ( ®éc tè ruét) ®éc víi ®­êng ruét vµ g©y Øa ch¶y, Hemolyzin cã t¸c dông dung gi¶i hång cÇu. C¸c siderophor liªn kÕt s¾t nh­aerobactin 4.4.4. Plasmid m· ho¸ trao ®æi chÊt phøc t¹p C¸c plasmid khæng lå, kÝch th­íc kho¶ng 300-1200 kb, ®­îc gäi lµ c¸c mega plasmid m· hãa c¸c gen cè ®Þnh nit¬ t¹o nèt sÇn, qóa tr×nh nitrat ho¸. C¸c plasmid cã vai trß trong tiÕn ho¸. 4.4.5. C¸c thÕ hÖ plasmid + C¸c plasmid thÕ hÖ thø nhÊt: lµ c¸c plasmid t×m thÊy trong tù nhiªn (ColE1, pSC101,…), + C¸c plasmid thÕ hÖ hai: c¸c plasmid ®­îc t¹o ra b»ng c¸ch tËp trung c¸c ®Æc tÝnh quý cña nhiÒu plasmid tù nhiªn vµo mét plasmid. + C¸c plasmid thÕ hÖ ba: ®©y lµ c¸c plasmid m¹nh nhÊt hiÖn nay víi 2 ®Æc tÝnh c¬ b¶n lµ : (1) kÝch th­íc nhá nªn sao chÐp rÊt nhanh, t¹o ®­îc nhiÒu b¶n sao trong vi khuÈn; (2) cã mang mét polylinker (polycloning site). 5. GIỚI HẠN VÀ CẢI BiẾN CƠ SỞ KỸ THUẬT GEN HiÖn t­îng giíi h¹n vµ enzym giíi h¹n do Hamilton Smith vµ céng sù ph¸t hiÖn ®Çu tiªn (1970) ë vi khuÈn Hemophilus influenzae. B×nh th­êng tÕ bµo VK bÞ nhiÔm phage th­êng bÞ phage ph¸ hñy. Mét sè chñng khi bÞ nhiÔm phage kh«ng bÞ phage ph¸ hñy mµ cã kh¶ n¨ng ph©n hñy ADN phage, nhê mét sè lo¹i enzym ®Æc hiÖu trong tÕ bµo VK. 5. GIỚI HẠN VÀ CẢI BiẾN CƠ SỞ KỸ THUẬT GEN HÖ thèng enzym ph¸ huû ADN l¹ x©m nhËp vµ b¶o vÖ ADN b¶n th©n lµ hÖ thèng enzym giíi h¹n. HÖ thèng enzym giíi h¹n (restrictase) cã hai lo¹i ho¹t tÝnh enzym: endonuclease vµ methyltransferase. C¶ hai thÓ hiÖn ho¹t tÝnh ë mét ®o¹n x¸c ®Þnh tr×nh tù ph©n biÖt. Methyltransferase c¶i biÕn tr×nh tù ADN tÕ bµo (methyl ho¸ adenyl ë vÞ trÝ N6 khi sao chÐp), vµ råi endonuclease ®­îc ho¹t ho¸, ADN l¹ kh«ng ®­îc c¶i biÕn lµ c¬ chÊt cho enzym nµy. 5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n C¨n cø vµo kh¶ n¨ng nhËn biÕt vµ vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu ng­êi ta chia enzym giíi h¹n lµm 3 lo¹i: Enzym giíi h¹n Lo¹i I ®­îc cïng 1 protein mang c¶ hai ho¹t tÝnh, tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc biÖt, c¾t ADN ngÉu nhiªn. Enzym giíi h¹n Lo¹i II cã endonuclease vµ methyltransferase ®­îc mang bëi 2 protein kh¸c nhau, cã tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc hiÖu, vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu vµ n»m trong vïng nhËn biÕt, thÓ hiÖn sù ®èi xøng quay kÐp, ®­îc sö dông trong t¹o dßng nh©n b¶n gen. 5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n  Enzym giíi h¹n lo¹i III ®­îc cïng mét protein mang c¶ hai ho¹t tÝnh, cã vÞ trÝ nhËn biÕt ®Æc hiÖu vµ vÞ trÝ c¾t còng ®Æc hiÖu. Cã hµng tr¨m enzym giíi h¹n th­¬ng m¹i. C¸c RE c¾t ®o¹n ADN lÖch ®i t¹o ra ®Çu dÝnh (cè kÕt), cßn sè enzym kh¸c nÕu c¾t trªn cïng mét vÞ trÝ sÏ t¹o ra c¸c ®Çu b»ng (tï). C¸c ®o¹n ADN víi c¸c ®Çu dÝnh bï t¹o lk hydro, sau ®ã ligase hµn l¹i, t¹o lk míi Mét sè enzym giíi h¹n Nguån gèc enzym Escherichia coli RY13 Haemophilus haemolyticus Brevibacteriu m albidum Haemophilus aegyticus Tªn Trình tù nhËn gäi biÕt EcoRI 5' G A A* T T C 3' 3' HhaI BalI HaeIII 5' 3' 5' 3' 5' 3' C T T A* A G G C* G C C G C* G 3' 5' T G G C* C A C C* G G G G C* C C C* G G 5' A T 3' 5' 3' 5' 5.2. ThiÕt kÕ c¸c plasmid (vector) t¸i tæ hîp NÕu 2 lo¹i ADN ®­îc xö lý víi cïng 1 RE (restrictase) th× mçi ADN sÏ cã ®Çu dÝnh t­ ¬ng hîp nhau vµ 2 ®o¹n ADN Êy sÏ g¾n l¹i ®­îc víi nhau t¹o thµnh ADN duy nhÊt. Plasmid mµ cã chøa 2 lo¹i ADN cã nguån kh¸c nhau ®­îc gäi lµ plasmid t¸i tæ hîp. Enzim cắt Enzim cắt Tách ADN NST của “tế bào cho” Đoạn ADN bị cắt ra Gắn đoạn bị cắt vào plasmid nhờ enzim nối ADN tái tổ hợp Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận E.coli Enzim cắt Tách ADNnst tb cho ADN tái tổ hợp Chuyển ADNtth vào TB nhận Tách plasmit Enzim cắt 5.2. ThiÕt kÕ c¸c plasmid (vector) t¸i tæ hîp Cã thÓ g¾n gen (b¶n sao cADN) cña sinh vËt nh©n thËt bËc cao (vd v­în, ng­êi) vµo 1 plasmid, theo c¸c b­íc sau: tõ m« vËt chñ ta chiÕt lÊy prem-ARN tõ gen môc tiªu råi lo¹i bá intron vµ ghÐp nèi c¸c exon ta ®­îc m-ARN tt. Tõ m-ARN tr­ëng thµnh nhê enzym phiªn m· ng­îc tæng hîp cADN (kü thuËt RT-PCR), vµ cADN ®­îc ghÐp víi plasmid t¹o thµnh plasmid lai. C¸c b­íc chÝnh chÕ t¹o plasmid t¸i tæ hîp 5.3. §­a plasmid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn  BiÕn n¹p: xö lý tÕ bµo nhËn víi dung dÞch CaCl2 ë nhiÖt ®é thÊp (0-4ºC víi E. coli), bæ sung plasmid tt hîp råi ®un nãng tÕ bµo nhËn (tíi 42ºC víi E. coli) ®Ó g©y shock nhiÖt chung. Nhê vËy tÝnh thÊm cña tÕ bµo VSV thay ®æi, cho phÐp plasmid x©m nhËp tÕ bµo. TÕ bµo sau khi bÞ xö lý víi shock ®iÖn (xung ®iÖn), shock ®iÖn t¹o thµnh c¸c mao dÉn qua ®ã plasmid cã thÓ dÔ dµng x©m nhËp tÕ bµo. Ng­êi ta sö dông c¸c gen kh¸ng kh¸ng sinh nh­kh¸ng tetracyclin, ampicilin ®Ó lµm dÊu hiÖu nhËn biÕt tÕ bµo ®· dung n¹p plasmid. 5.3. §­a plasmid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn Khi tÕ bµo VK nhËn plasmid t¸i tæ hîp, tÕ bµo sinh s¶n t¹o thµnh 1 quÇn thÓ lín c¸c tb gièng nhau gäi lµ mét dßng. V× plasmid lµ t¸c nh©n biÕn truyÒn nhê ®ã mµ gen míi ®­îc ®­a vµo tb vk, nªn plasmid cßn ®­îc gäi lµ vect¬ t¹o dßng. Víi mét sè plasmid, viÖc cho vµo m«i tr­ êng nång ®é thÊp cña chloramphenicol d® viÖc sao chÐp plasmid mÊt ®iÒu khiÓn khiÕn hµng tr¨m b¶n sao plasmid (vµ tÊt nhiªn gen ngo¹i lai trong ®ã) ®­îc tæng hîp bëi mçi mét tÕ bµoVK. Sù sao chÐp bÊt th­êng nh­vËy cña plasmid gäi lµ sù khuyÕch ®¹i. 6. Kt PCR vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN 6.1. Ph¶n øng chuçi trïng hîp (PCR) Ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR lµ ph­¬ng ph¸p t¹o dßng (khuÕch ®¹i) ADN in vitro, (c«ng bè th¸ng 10 n¨m 1985 nhê ph¸t minh cña Karl Mullis) Ph­¬ng ph¸p PCR cho phÐp khuÕch ®¹i, t¹o mét sè l­îng rÊt lín b¶n sao cña gen ( hay mét ®o¹n ADN) trong mét thêi gian ng¾n. Ph­¬ng phaps PCR ®· t¹o ra mét b­íc nh¶y vät cña sinh häc ph©n tö vµ kü thuËt gen. 6.1.1. Nguyªn t¾c Trong ®k in vitro víi c¸c ®o¹n måi chuyªn biÖt b¾t cÆp ®­îc víi 2 ®Çu mét ®o¹n ADN, enzym taq ADN polymerase, ion Mg2+ vµ c¸c nucleotid t­¬ng øng, trong 3 chu kú nhiÖt thÝch hîp ®o¹n ADN ®· nªu sÏ ®­îc tæng hîp khuÕch ®¹i lªn mét c¸ch m¹nh mÏ Måi (®o¹n ADN måi - probe) lµ ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng sãng ®«i bæ sung víi 1 ®Çu cña m¹ch khu«n vµ ADN polymerase sÏ nèi dµi måi ®Ó t¹o thµnh m¹ch ADN míi  CÇn cã th«ng tin tèi thiÓu vÒ tr×nh tù cần khuếch ®¹i, ®ñ ®Ó t¹o c¸c måi bæ sung chuyªn biÖt. Cã mét måi xu«i vµ mét måi ng­ îc (so víi chiÒu phiªn m·).  6.1.2. Thùc nghiÖm Gåm chuçi pø 3 chu kú nhiÖt B­íc 1: Ph©n tö (®o¹n) ADN ®­îc biÕn tÝnh ë 94 - 95oC, 30 gi©y - 1 phót, giai ®o¹n biÕn tÝnh B­íc 2: NhiÖt ®é 38-70oC, 30 gi©y - 1 phót. §©y lµ giai ®o¹n lai. B­íc 3: NhiÖt ®é 72oC, vµ ®­îc gi÷ ë ®©y tõ 30 gi©y - vµi phót ADN polymerase chÞu nhiÖt (Taq ADN pol) tæng hîp ADN sîi ®óp míi tõ c¸c ADN sîi ®¬n C¸c b­íc chu kú cña kü thuËt PCR 3' 5' A LÆ p 94-95o C 3' 5' 5' 3' l¹ i n lÇn 5' 3' B 38-70o C 3' 5' 5' 3' C o 72 C 3' 5' 5' 3' 6.1.2. Thùc nghiÖm Nh­vËy, mét chu kú 3 b­íc sÏ ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ mçi lÇn sÏ lµm t¨ng gÊp ®«i l­îng mÉu ADN cña lÇn tr­íc. Sau 30 chu kú sù khuÕch ®¹i sÏ t¨ng lªn 106 lÇn so víi l­îng khu«n ban ®Çu. Tïy thuéc vµo sè l­îng khu«n ban ®Çu ®Ó chän sè khu«n chu kú phï hîp , Các yếu tố cần thiết cho PCR ADN khuôn Các nucleotid tự do (dNTP) Mồi Enzym ADN polymerase Dung dịch đệm cho PCR Thiết bị thực hiện phản ứng Các yếu tố cần thiết cho PCR ADN khuôn: tinh sạch là một trong những yếu tố đảm bảo cho PCR chính xác. Kích thước của đoạn khuôn không quá lớn thường 3 kb là tốt nhất. Các nucleotid tự do (dNTP) tùy thuộc vào kích thước đoạn gen và số chu kỳ PCR được chọn. Nếu nồng độ các loại dNTP ít không đủ thực hiện. Nếu quá nhiều pứ cũng khó thực hiện Các yếu tố cần thiết cho PCR * Mồi: + Một cặp mồi trong PCR gồm một mồi xuôi F và một mồi ngược R.Yêu cầu nhiệt độ Tm của các không chênh lệch quá lớn + Mồi không quá ngắn (kết quả PCR không chính xác ) hoặc quá dài (khó đảm bảo thành công của PCR) + Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp với đầu 3’ cuả mạch khuôn. Các mồi không được bắt cặp với nhau. + Trong PCR phải xác định nồng độ mồi phù hợp Các yếu tố cần thiết cho PCR *Enzym ADN polymerase: là yếu tố rất quan trọng.Thường sử dụng các enzym chịu nhiệt. Nồng độ của enzym sử dụng phải vừa đủ. + Taq ADN polymerase (VK suối nước nóng Thermus aquticus) +Tth ADN polymerase (Thermus theromophylus) hoạt động như enzym phiên mã ngược khi có mặt ARN làm khuôn và ion Mn2+ kết quả thu được cADN từ ARN khuôn ban đầu. + Một số enzym khác như T4 ADN polymerase , Vent ADN polymerase , Pfu ADN polymerase … C¸c øng dông cña PCR Kỹ thuật PCR chuẩn (standard) Kỹ thuật PCR ngược (RT – PCR) Kỹ thuật PCR lồng ( Nested PCR) Kỹ thuật PCR đảo (inverse PCR) Kỹ thuật PCR phức (Multiplex PCR) Kỹ thuật PCR tại chỗ (PCR in situ) C¸c øng dông cña PCR Sử dụng PCR tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập các bản đồ gen, giải trình tự gen. Nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loạn di truyền . PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh vật và trong phân loại. ……. 6.2. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN * Gi¶i tr×nh tù gen ( ADN sequenceing) lµ ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh vÞ trÝ s¾p xÕp c¸c nucleotid trong ph©n tö ADN * Mét sè ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù: + Ph­¬ng ph¸p hãa häc cña Maxam vµ Gilbert (1977) vµ + Ph­¬ng ph¸p enzym häc cña Sanger vµ céng sù (1977). + Ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù b»ng m¸y tù ®éng Phương pháp enzyme (1977) Frederick (Fred) Sanger Ph­¬ng ph¸p enzym Nguyªn lý: Ph­¬ng ph¸p Sanger dùa vµo sù tæng hîp m¹ch bæ sung (bï) cña tr×nh tù ADN m¹ch ®¬n cÇn x¸c ®Þnh nhê enzym ADN polymerase. Ngoµi 4 Nu cÇn thiÕt cßn cÇn 4 dideoxynucleotid lµm ngõng p.ø. [A] [G] H [C] H [T] H H H H H H H H H H O 3' OH O O 3' OH O 3' OH OH ' 3 5' H 5' H 5' H 5' H O P O H2C HO P O H2C O P O H2C O P O H2C OH O O O O M¹ch ®¬n polynucleotid cña ADN 6.2. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN Phương pháp Sanger End labeled primer SANGER DIDEOXY SEQUENCING ddNTP Reaction Mix 5’DNA Polymerase 4 tubes C +dNTPs ddATP + one of: ddTTP ddCTP ddGTP 5’C 5’C 5’C In the ddGTP reaction there is a random chance a ddGTP will be incorporated across from a C 5’ C G T A A G G T A T C C 3’ T A G autoradiograph of dried sequencing gel Sequence is complementary to the strand being sequenced! Phương pháp Sanger Giả trình tự gen ADN bằng máy tự động Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc của sử dụng ddNTP của Sanger và cộng sự. Trong quá trình tổng hợp đánh dấu mỗi loại ddNTP bằng một flourchrom có màu sắc khác nhau => những olygonucleotid cùng kết thúc tại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gen polyacrylamid kết quả sẽ được đọc qua hệ thống gắn với máy tính điều khiển 7. Ứng dụng của kỹ thuật gen C«ng nghÖ d­îc phÈm sö dông kü thuËt biÕn ®æi gen ®· s¶n xuÊt ®­îc c¸c ho¹t chÊt, d­îc chÊt nh­: Sản xuất vacin phòng bệnh lở mồm long móng , vaccin tái tổ hợp và vaccin phòng chống viêm gan B. Vaccin chống AIDS. Sản xuất insulin Kỹ thuật di truyền VSV với nông nghiệp Các hệ thống biểu hiện gen Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết định sự thành bại của kỹ thuật gen. Hệ thống tế bào chủ thường được sử dụng trong biểu hiện gen gồm: Tế bào Vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào trứng của động vật có vú, bacilovirus… Biểu hiện gen trong tế bào VK VK E.coli được ưa chuộng trong biểu hiện gen: - E.coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh - Cấu trúc và đặc điểm di truyền đã được biết tương đối rõ. - Môi trường nuôi cấy kinh tế. Vaccin Vaccin truyền thống: là vi khuẩn hoặc virus sống đã làm giảm độc lực. Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lại. Vaccin TTH: protein kháng nguyên nhờ kỹ thuật DNA. Ưu điểm: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virus. Vaccin TTH có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS, …) 7.1. Vaccin bÖnh lë måm long mãng , vacin t¸i tæ hîp vµ vacin chèng viªm gan B . Gen protein vá ®Æc hiÖu cña virus g©y lmlm ë ®éng vËt ®­îc ®­a vµo plasmid vµ plasmid t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo E.coli. ChiÕt xuÊt dÞch nu«i cÊy ®Ó thu ®­îc vaccin. Tr­êng hîp vk Vibrio cholera ta lo¹i bá 1 phÇn gen m· ho¸ enterotoxin cña vi khuÈn tr­íc khi dïng chóng ®Ó s¶n xuÊt vaccin, kq vÉn tèt. M¸u cña nh÷ng ng­êi m¾c bÖnh virus viªm gan B (HBV) kinh niªn cã chøa c¸c h¹t protein nhá v« h¹i cña virus. §©y lµ protein HBsAg. S. cerevisieae biÕn ®æi gen cã thÓ s¶n xuÊt HBsAg lµm vaccin. 7.3. S¶n xuÊt insulin Nguyªn lý Gen chuyªn tr¸ch vÒ cÊu tróc insulin tõ c¸c nguån kh¸c nhau (tæng hîp hãa häc hay ph©n lËp tõ c¸c nguån kh¸c nhau råi ®­îc khuyÕch ®¹i) ®­îc ®­a vµo tbµo VSV. Khi c¸c VSV ph¸t triÓn sÏ biÓu hiÖn gen míi nµy vµ t¹o ra ho¹t chÊt insulin mµ ta mong muèn. 7.3. S¶n xuÊt insulin Insulin bao gåm 2 m¹ch polypeptid: m¹ch dµi 30 (B) vµ m¹ch ng¾n 21 (A) ®¬n vÞ acid amin. Gen m· ho¸ polypeptid nµy chøa hai chuçi ADN: chuçi dµi chøa 18 ph©n ®o¹n nucleotid, vµ chuçi ng¾n chøa 11 ph©n ®o¹n. Hai chuçi nµy ®­îc tæng hîp thµnh 2 ®o¹n gen riªng biÖt vµ ®­îc ghÐp vµo 1 plasmid. Plasmid ®­îc biÕn n¹p vµo E.coli. TiÕn hµnh lªn men chñng E.coli biÕn ®æi gen. S¶n phÈm thu ®­îc hai m¹ch A, B ®­îc g¾n l¹i víi nhau t¹o ra in sulin ho¹t ®éng (KT 2 block). H×nh 5.15. S¶n xuÊt insulin víi kü thuËt 2 block 7.3. S¶n xuÊt insulin Gly Ile Val Glu Chuçi A S S Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn S S S S His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gln Asn Gly Chuçi B Glu Val Arg Phe Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe Gly 7.3. S¶n xuÊt insulin Ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt insulin mét b­íc: + G¾n gen m· hãa tæng hîp proinsulin vµo tÕ bµo E. coli råi tiÕn hµnh lªn men E.coli biÕn ®æi gen vµ chiÕt lÊy proinsulin. + Thñy ph©n tiÒn insulin b»ng protease cho ta insulin ho¹t ®éng. + Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông víi tÕ bµo biÓu hiÖn gen lµ nÊm men S.cerevisiae. S¶n xuÊt insulin theo kü thuËt mét block Ứng dụng của kỹ thuật gen 1978 Insulin của người được các nhà khoa học của Genetech nhân tách dòng vào E. coli. Genetech sau đó đã chuyển giao công nghệ sản xuất insulin cho Eli Lilly. Năm 1982, insulin người, hay Humulin, trở thành loại thuốc DNA tái tổ hợp đầu tiên được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Hoa Kỳ (FDA) cấp phép Sản xuất insulin tái tổ hợp Human Insulin Production by Bacteria and cut with a restriction enzyme 6) join the plasmid and human fragment Human Insulin Production by Bacteria . Route to the Production by Bacteria of Human Insulin One cell with the recombinant plasmid This is the step when gene cloning takes place. The single recombinant plasmid replicates within a cell. A fermentor used to grow recombinant bacteria. Route to the Production by Bacteria of Human Insulin The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene. Preproinsulin is difficult for E.coli to produce Insulin Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total A chain = 21 amino acids B chain = 30 amino acids 7.4. Kü thuËt di truyÒn vsv víi n«ng nghiÖp C¸c chñng Pseudomonas syringae vµ Pseudomonas fluorescens biÕn ®æi gen ®Ó b¶o vÖ c©y qu¶ chèng l¹i s­ ¬ng gi¸. Nhê kü thuËt di truyÒn, tÝnh kh¸ng nhiÖt vµ chÞu h¹n cña c©y trång ®­îc c¶i thiÖn, còng nh­cã thÓ t¹o ra c¸c c©y trång cã tÝnh kh¸ng c«n trïng vµ c¸c VSV g©y bÖnh. ViÖc t¹o ra vµ kÕt hîp thµnh c«ng c¸c vi khuÈn cè ®Þnh nit¬ cã kh¶ n¨ng céng sinh víi c¸c c©y ngò cèc Kü thuËt di truyÒn VSV  Kü thuËt di truyÒn còng cã thÓ cung cÊp c¸c biÖn ph¸p míi cho b¶o vÖ m«i tr­êng. lai ghÐp gen ph©n gi¶i dÇu ho¶. Tuy nhiªn kü nghÖ di truyÒn còng cã thÓ g©y nhiÒu t¸c h¹i: gen t¹o thµnh ®éc tè, c¸c vÊn ®Ò ®¹o ®øc…. C¸c thÝ nghiÖm liªn kÕt toµn bé hay mét phÇn ADN tõ c¸c virus sinh khèi u, hay c¸c virus kh¸c vµo trong c¸c nh©n tè ADN sao chÐp ®éc lËp (c¸c plasmid cña vi khuÈn hay c¸c ADN virus kh¸c) còng ®Æt ra nh÷ng rñi ro t­¬ng tù. 8. D­îc häc thêi hËu genom ng­êi N¨m 2005 c¸c nhµ khoa häc c«ng bè ®· gi¶i m· ®­îc bé genom ng­êi…. VÒ ph­¬ng diÖn d­îc häc ngµy nay ®ang dÇn h×nh thµnh m«n khoa häc míi lµ Di truyÒn d­îc häc (Pharmacogenetics),