Nội dung

Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ðộc lập – Tự do – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên : Phạm Thị Trang Khóa: 49 Số hiệu sinh viên : 20043179 Viện : Công nghệ sinh học và thực phẩm Ngành : Công nghệ các sản phẩm lên men ðề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis ñể khử protein vỏ tôm”. Giáo viên hướng dẫn : TS. Lê Thanh Hà Ngày giao luận văn : Ngày hoàn thành luận văn : Hà Nội, ngày 5 tháng 6 năm 2009 Trưởng bộ môn Giảng viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng TS Lê Thanh Hà LỜI CẢM ƠN ============================================================== 1 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Em xin chân trọng cảm ơn Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường ðại học Bách Khoa Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho em thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến TS. Lê Thanh Hà ñã tận tâm, chu ñáo hướng dẫn và có những chỉ dẫn quan trọng, quý giá giúp em hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy cô, anh chị cán bộ các Phòng, Bộ môn trong Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm ñã nhiệt tình quan tâm, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến những người thân trong gia ñình cùng toàn thể các bạn bè ñã ñộng viên và giúp ñỡ em vượt mọi khó khăn hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày … tháng … năm … SV thực hiện Phạm Thị Trang ============================================================== 2 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Mục Lục MỞ ðẦU .................................................................................................................... 8 I. TỔNG QUAN...................................................................................................... 9 I.1 HIỆN TRẠNG KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN ....................... 9 I.1.1 Thành phần phế phẩm tôm ....................................................................... 9 I.1.2 Phế thải trong công nghiệp chế biến......................................................... 9 I.1.3 Cấu tạo và thành phần hoá học của phế liệu tôm ................................... 10 I.1.3.1 Cấu tạo hóa học của phế liệu vỏ tôm .............................................. 10 I.1.3.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm ..................................................... 11 I.2 MỘT SỐ TÍNH CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITIN VÀ CHITOSAN.. 13 I.2.1 Tổng quan về chitin ................................................................................ 13 I.2.1.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên ................................................. 13 I.2.1.2 Cấu tạo của chitin ............................................................................ 13 I.2.1.3 Tính chất của chitin ......................................................................... 14 I.2.2 Tổng quan về chitosan ............................................................................ 15 I.2.2.1 Cấu trúc phân tử của chitosan ......................................................... 15 I.2.2.2 Tính chất của chitosan..................................................................... 15 I.2.3 Ứng dụng của chitin và chitosan ............................................................ 16 I.2.3.1 Trong công nghệ thực phẩm............................................................ 16 I.2.3.2 Trong y dược ................................................................................... 18 I.2.3.3 Trong xử lý môi trường................................................................... 20 I.2.3.4 Trong nông nghiệp .......................................................................... 20 I.2.3.5 Trong công nghệ mỹ phẩm ............................................................. 21 I.2.4 Phương pháp thu nhận chitin .................................................................. 21 I.2.4.1 Phương pháp hóa học ...................................................................... 21 I.2.4.2 Phương pháp cơ học ........................................................................ 23 I.2.4.4 Phương pháp sinh học ..................................................................... 23 I.3. Bacillus subtilis .......................................................................................... 25 I.3.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis.................................................. 25 I.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng của Bacillus subtilis ................. 25 I.3.2.1 Môi trường dinh dưỡng ................................................................... 25 I.3.2.2 Nhiệt ñộ ........................................................................................... 27 I.3.2.3 pH .................................................................................................... 27 I.3.2.4 Nguồn O2 ................................................................................................27 I.3.3 Tình hình nghiên cứu quá trình khử protein phế liệu tôm bằng Bacillus subtilis tại Việt Nam và trên thế giới................................................................. 27 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 29 II.1 VẬT LIỆU ...................................................................................................... 29 II.1.1 Vi sinh vật ........................................................................................... 29 II.1.2. Vỏ tôm................................................................................................. 29 ============================================================== 3 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= II.1.3 Các loại thiết bị sử dụng ......................................................................... 29 II.1.4 Các môi trường cơ bản sử dụng trong nghiên cứu.................................. 30 II.1.5 Các hóa chất sử dụng .............................................................................. 30 II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 30 II.2.1 Phương pháp vi sinh................................................................................ 30 II.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng ......................................................... 30 II.2.1.2 Phương pháp lên men vỏ tôm.......................................................... 30 II.2.2 Phương pháp hóa sinh ............................................................................ 30 II.2.2.1 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch ................................................................................................... 30 II.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp Anson cải tiến ......................................................................................................... 31 II.2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret ………………………………………………………………………………32 II.2.3. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm bề mặt ñáp ứng........................ 34 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 35 III.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease cao ............................................. 35 III.1.1 ðịnh tính bằng phương pháp ño ñường kính vòng thuỷ phân................ 35 III.1.2 ðịnh lượng bằng phương pháp ño hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến .............................................................................. 36 III.2 Tối ưu hóa ñiều kiện sinh tổng hợp proteaza ............................................... 37 III.2.1 Chọn các yếu tố ảnh hưởng .................................................................... 37 III.2.1.1 Ảnh hưởng của pH....................................................................... 37 III.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCl2 .................................................... 38 III.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường ................................................... 39 III.2.1.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .............................................. 39 III.2.2 Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt ñáp ứng........ 40 III.3 Tìm ñiều kiện thích hợp cho quá trình lên men phế liệu tôm loại protein ... 43 IV. KẾT LUẬN......................................................................................................... 47 V. PHỤ LỤC………………………………………………………………………..47 ============================================================== 4 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= TÓM TẮT NỘI DUNG Chitin có rất nhiều trong vỏ của tôm, ñồng thời dẫn xuất của nó là chitosan lại có hoạt tính sinh học cao và ñược ứng dụng nhiều trong công nghiệp dược, trong nông nghiệp và trong công nghệ thực phẩm…Qui trình thu hồi chitin từ vỏ tôm gồm hai quá trình là quá trình loại bỏ chất khoáng và loại bỏ protein. Phương pháp khử protein sử dụng hiện nay là phương pháp hóa học dùng bazo mạnh như NaOH. Phương pháp này có nhược ñiểm là chất thải của quá trình có chứa chất ăn mòn, làm ô nhiễm môi trường, dịch thủy phân có chất lượng kém không thu hồi lại ñược. Hiện nay nhiều nghiên cứu tập trung vào sử dụng phương pháp sinh học ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme proteaza thuỷ phân loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu, khắc phục các nhược ñiểm của phương pháp hóa học. Mục ñích của ñề tài nghiên cứu này là tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính proteaza cao, tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy thu dịch enzym có hoạt lực proteaza cao và ứng dụng trong khử protein của vỏ tôm. Từ 11 chủng vi khuẩn chúng tôi ñã chọn ñược chủng Bacillus subtilis DT2 có hoạt lực proteaza cao. Tiến hành qui hoạch thực nghiệm bằng phương pháp bề mặt ñáp ứng ñã chọn ñược ñiều kiện tối ưu ñể thu dịch enzyme là CaCl2 0,5g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 và thời gian nuôi cấy là 14h. Ứng dụng dịch enzyme của chủng Bacillus subtilis có thể khử ñược 96,14% protein trong vỏ tôm. ============================================================== 5 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ðỒ Tên bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần hoá học của phế liệu tôm ………………………………….10 Bảng 2.1: Gía trị mã hoá và thực nghiệm…………………………………………. 31 Bảng 3.1: ðuờng kính khuẩn lạc và vòng thuỷ phân................................................33 Bảng 3.2: ðường kính vòng thuỷ phân…………………………………………….34 Bảng 3.3: Hoạt ñộ proteaza của 3 chủng nghiên cứu………………………………34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược…………….35 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy………………………………………39 Bảng 3.6:Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong phương pháp quy hoạch thực nghiệm bề mặt………………………………………………………………………40 Bảng 5.1: Các thì nghiệm thực nghiệm tiến hành trong qui hoạch tối ưu và kết quả…………………………………………………………………………………..45 ============================================================== 6 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ðỒ THỊ Tên hình vẽ Trang Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2........................37 Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2….37 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2………………………………………………………………………………... 39 Hình 3.4. Ảnh hưởng của từng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza khi cố ñịnh các yếu tố còn lai. A, B, C và D là các giá trị của các biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian và pH tương ứng………………………………………………………….41 Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian và nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza...........41 Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH và nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza…………….42 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian và nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza……43 Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ và thời gian lên men ñến hiệu suất lên men……….45 ============================================================== 7 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= MỞ ðẦU Trong những năm gần ñây, ngành nuôi trồng, khai thác và chế biến thủy sản xuất khẩu Việt Nam ñã phát triển mạnh mẽ, trong ñó tôm ñông lạnh xuất khẩu ñã ñem lại thu nhập nguồn ngoại tệ cho ñất nước rất ñáng kể. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển ñó thì một lượng lớn phế liệu thải ra cũng rất lớn. Do vậy, một vấn ñể ñặt ra là nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu ñể sản suất ra các mặt hàng có giá trị gia tăng, nhằm ñảm bảo yêu cầu sản xuất sạch hơn, ñồng thời cũng ñem lại nguồn kinh tế ñáng kể. Hiện nay, việc tận dụng phế liệu tôm ñược thực hiện theo hướng sản xuất chitin – chitosan. Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất chitin và chitosan từ vỏ tôm cần phải qua các bước xử lý như khử khoáng và protein. Trong nước thải có chứa một thành phần lớn và quan trọng là protein. Chính vì vậy việc nghiên cứu ñể ñưa ra quy trình thu hồi protein là rất cần thiết. Nếu thu hồi hỗn hợp này ta có thể sử dụng ñể bổ sung vào thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản vừa góp phần làm tăng giá trị kinh tế cho quy trình sản xuất chitin vừa góp phần giải quyết vấn ñề ô nhiễm môi trường do dịch thải này gây ra. Nhận thấy tính cấp thiết của vấn ñề thu hồi protein từ quy trình sản xuất chitin chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis ñể khử protein vỏ tôm” Mục ñích của ñề tài : Tối ưu hoá ñiều kiện sinh tổng hợp của Bacillus subtilis nhằm thu ñược proteaza có hoạt lực cao nhất, ñồng thời ñem ứng dụng vào trong thuỷ phân protein trong vỏ tôm sao cho hiệu suất thuỷ phân là cao nhất. ============================================================== 8 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= I. TỔNG QUAN I.1 HIỆN TRẠNG KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN I.1.1 Thành phần phế phẩm tôm Tôm là ñối tượng quan trọng của ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản Việt Nam. Thịt tôm có giá trị dinh dưỡng cao và có mùi vị thơm ngon ñặc trưng, rất hấp dẫn. Hiện nay, sản phẩm tôm ñông lạnh xuất khẩu ñã góp 70-80% tổng kim ngạch xuất khẩu của toàn ngành (theo thống kê kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của Việt Nam trong vòng 6 tháng ñầu năm 2008). Hiện nay ở nước ta, kỹ thuật khai thác và nuôi tôm rất phát triển và ngày càng cung cấp nhiều nguyên liệu cho các nhà máy chế biến thủy sản trong nước và xuất khẩu nhiều mặt hàng như: Tôm tươi nguyên con cấp ñông IQF hoặc Block Tôm vỏ bỏ ñầu cấp ñông IQF hay Block Tôm là surimi Tôm bỏ vỏ ñóng hộp Tôm bỏ vỏ, còn ñốt ñuôi cấp ñông IQF Tôm bỏ vỏ, bỏ chỉ lưng hấp cấp ñông ðiều này chứng tỏ tôm là một mặt hàng ñem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho ñất nước nhưng ñồng thời cũng thải ra một lượng ñáng kể phế liệu, chủ yếu là vỏ và ñầu tôm. Ngoài ra, có một lượng ñáng kể thịt vụ do bóc nõn không cẩn thận hoặc một số tôm bị thải loại do biến màu, chất lượng không ñảm bảo. Tùy theo giống, loài và phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu này có thể thay ñổi từ 40% (ñối với tôm sú) ñến 60% (ñối với tôm càng xanh) lượng nguyên liệu thu mua. ðối với sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột thì mất mát theo vỏ tôm và ñuôi khoảng 25%. Nhìn chung, trong phế liệu tôm thì trọng lượng phần ñầu thường gấp 3 – 4 lần so với phần vỏ và ñuôi. ============================================================== 9 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= I.1.2 Phế thải trong công nghiệp chế biến Tôm là nguồn Thuỷ sản dồi dào và có giá trị kinh tế cao nhưng việc khai thác, ñánh bắt phụ thuộc rất lớn vào ñiều kiện tự nhiên và mang tính mùa vụ vì vậy ngoài ñánh bắt tự nhiên người ta còn ñẩy mạnh theo hướng nuôi trồng ñảm bảo cung cấp nguyên liệu một cách thường xuyên cho các nhà máy chế biến Thủy sản xuất khẩu. Giáp xác là nguồn nguyên liệu Thủy sản dồi dào chiếm từ 30-35% tổng sản lượng nguyên liệu ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến Thuỷ sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng ñông lạnh giáp xác chiếm từ 70-80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến ñã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn. Riêng ở tỉnh Khánh Hòa lượng phế liệu này vào khoảng 2257 tấn/năm. Theo số liệu thống kê năm 1999 phế liệu giáp xác trên toàn thế giới khoảng 5,ll triệu tấn/năm. Ở ñịa bản tỉnh Khánh Hòa trong những năm gần ñây mặt hàng tôm ñông lạnh ñược ñẩy mạnh nhất là ở các xí nghiệp chế biến Thủy sản như: Xí nghiệp ðông lạnh Nam Trung Bộ, Xí nghiệp ðông lạnh Việt Long, Xí nghiệp ðông lạnh Việt Thắng, Xí nghiệp ðông lạnh Nha Trang (hay công ty F17),… Việc tiêu thụ một số lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chế biến thủy sản ñã thải ra một lượng lớn phế liệu trong ñó phế liệu vỏ, ñầu tôm là chủ yếu. Các loại phế liệu này nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường trầm trọng và nếu ñem xử lý chất thải thì chi phí sẽ rất lớn. Ngày nay ñã có rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm ñể sản xuất các chế phẩm có giá trị trong ñó quan trọng nhất là việc sản xuất chitinchitosan từ vỏ giáp xác. I.1.3 Cấu tạo và thành phần hoá học của phế liệu tôm I.1.3.1 Cấu tạo hóa học của phế liệu vỏ tôm Vỏ chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì (epicuticle); Lớp màu; ============================================================== 10