Nội dung

viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung 6500 10/9/2007 Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n quyÒn 2006 thuéc VHH - VAST §¬n xin sao chÐp toµn bé hoÆc tõng phÇn tµi liÖu nµy ph¶i göi ®Õn ViÖn tr−ëng VHH - VAST trõ tr−êng hîp sö dông cho môc ®Ých nghiªn cøu. viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n th¶o viÕt xong 1/ 2006. Tµi liÖu nµy ®−îc chuÈn bÞ trªn c¬ së kÕt qu¶ thùc hiÖn §Ò tµi cÊp Nhµ n−íc, m· sè KC 10. 25 Danh s¸ch c¸n bé tham giathùc hiÖn ®Ò tµi Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c Chñ nhiÖm ®Ò tµi 1. GS.TSKH. TrÇn V¨n Sung ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN C¸n bé tham gia nghiªn cøu 1. PGS. TS. NguyÔn H÷u §Þnh Khoa Ho¸ Tr−êng §HKHTN, §HQG Hµ Néi 2. ThS. NguyÔn ViÖt Th¾ng 3. ThS. TrÇn V¨n Léc 4. ThS. TrÇn V¨n ChiÕn nt 5. ThS. TrÇn §øc Qu©n nt 6. CN. Ph¹m ThÞ Ninh nt 7. TS. TrÞnh ThÞ Thuû nt 8. TS. NguyÔn ThÞ Hoµng Anh nt 9. TS. NguyÔn Thanh §¹m 10. ThS. NguyÔn TuyÕt Mai 11. DS. Lª TiÕn Dòng 12. TS. Phïng ThÞ Vinh nt ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN BÖnh ViÖn K Hµ Néi nt XN D−îc phÈm TW I ViÖn KiÓm nghiÖm Môc lôc Tr 1. 2. Bµi tãm t¾t 1 PhÇn chÝnh b¸o c¸o 3 2.1. PhÇn tæng quan 3 2.1.1. Cyclophosphamide 3 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide 3 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide 5 11 2.1.2. TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña §Ò tµi 14 2.2. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi 19 2.2.1. Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide 19 Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide 28 Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ®−îc KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh, BP 2001 Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm cyclophosphamide 29 2.2.5. Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm 36 2.2.6. Nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng thuèc cyclophosphamide pha tiªm 39 2.2.6.1. §Ò c−¬ng nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 39 2.2.6.2. KÕt qu¶ nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 42 2.2.7. Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide 48 2.2.7.1. Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch n−íc 48 C¸c kÕt qu¶ kh¸c 50 2.1.1.3. 2.1.1.4. 2.1.1.5. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.7.2. 2.2.8. 9 13 32 33 49 3. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ 51 B¸o c¸o quyÕt to¸n tµi chÝnh Lêi c¶m ¬n Tµi liÖu tham kh¶o 55 1. Bµi tãm t¾t 1.1. §Æt vÊn ®Ò HiÖn nay ViÖt Nam vÉn ph¶i nhËp khÈu mét l−îng lín thuèc cyclophosphamide ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c cã nguyªn nh©n tù miÔn. Theo dù tÝnh, hµng n¨m sè tiÒn ®Ó nhËp khÈu cyclophosphamide riªng cho nhu cÇu ch÷a bÖnh ung th− lµ kho¶ng 26 tØ ®ång. §Ò tµi "Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" cã m· sè KC 10.25 ®Æt ra c¸c môc ®Ých sau ®©y: • Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide cã tÝnh kh¶ thi, vµ tÝnh kinh tÕ cao. • Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña cyclophosphamide; KiÓm nghiÖm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP. Thuèc bµo chÕ xong ph¶i ®¹t tiªu chuÈn thuèc tiªm cña D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu ®¸nh gi¸ l©m sµng giai ®o¹n I thuèc cyclophosphamide tæng hîp ®−îc trªn bÖnh nh©n ung th−. 1.2. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: 1.2.1. Nguyªn liÖu: C¸c ho¸ chÊt ®−îc sö dông cã ®é tinh khiÕt P. A. cña h·ng Merck, CHLB §øc. 1.2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: • C¸c ph−¬ng ph¸p dïng ®Ó ph©n tÝch cÊu tróc cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc lµ hiÖn ®¹i vµ phï hîp nh− phæ MS, LC/MS, IR vµ NMR (1H -, 13C NMR) ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. • C¸c ph−¬ng ph¸p tæng hîp ®−îc dùa theo patent cña §øc, Liªn minh Ch©u ¢u, Mü cã kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu tham kh¶o kh¸c, ®−îc thùc hiÖn t¹i tr−êng §HKHTN - §HQG Hµ Néi vµ ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN. 1 • C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vÒ y d−îc ®−îc sö dông lµ nh÷ng ph−¬ng ph¸p quy chuÈn cña Bé Y tÕ, ®−îc thùc hiÖn t¹i c¸c c¬ quan khoa häc do Bé Y tÕ chØ ®Þnh nh− ViÖn KiÓm nghiÖm, xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I vµ bÖnh viÖn K Hµ Néi. 1.3. C¸c kÕt qu¶ ®· ®¹t ®−îc: • §· tiÕn hµnh nghiªn cøu vµ ®Ò ra ®−îc quy tr×nh kh¶ thi cã hiÖu qu¶ kinh tÕ vµ øng dông quy tr×nh nµy ®Ó tæng hîp 4250 gam cyclophosphamide. • §· ®−a ra ®−îc bé phæ chuÈn cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc gåm: IR, MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR. • S¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ra ®· ®−îc nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n cÊp, ®−îc ph©n tÝch, kiÓm nghiÖm theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. TÊt c¶ c¸c tiªu chÝ ®Òu ®¹t. • Cyclophosphamide ®· ®−îc bµo chÕ thµnh thuèc bét pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP cña xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I. Thuèc vµ n−íc cÊt pha tiªm ®¹t tiªu chuÈn BP 2001. • Thuèc cyclophosphamide ®· ®−îc nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n I ®èi víi bÖnh nh©n ung th− t×nh nguyÖn t¹i bÖnh viÖn K Hµ Néi. KÕt qu¶: Víi liÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ c¸c bÖnh nh©n ®Òu cã ®¸p øng mét phÇn. LiÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an toµn. 1.4. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ • §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt c¸c môc tiªu ®· ®Ò ra vµ theo ®óng tiÕn ®é. • Thanh quyÕt to¸n tµi chÝnh theo ®óng dù to¸n vµ quy ®Þnh cña nhµ n−íc. • §Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ xem xÐt phª duyÖt giai ®o¹n tiÕp theo cña §Ò tµi ®Ó nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n II vµ III nh»m ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ chèng ung th− cña thuèc vµ ®−a ra s¶n xuÊt, ®¸p øng nhu cÇu trong n−íc, thay thÕ thuèc nhËp khÈu. 2 PhÇn chÝnh b¸o c¸o 2. 2.1. PhÇn tæng quan 2.1.1. Cyclophosphamide Cyclophosphamide cã tªn khoa häc lµ (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoÆc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,Otrimethylendiamidophosphat (I); c«ng thøc tæng lµ C7H15Cl2N2O2P. H2O, khèi l−îng ph©n tö lµ 279,1. C«ng thøc cÊu t¹o lµ: Cl O H2C N Cl H2C P O HN . H2O I Tinh thÓ cyclophosphamide cã mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, rÊt dÔ tan trong cån, tan võa ph¶i trong ete. 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide Cyclophosphamide ®−îc sö dông nhiÒu trong l©m sµng víi mét phæ t¸c dông réng vµ hiÖu qu¶ ®èi víi c¸c bÖnh ung th− ë ng−êi. Ngoµi lý do vÒ t¸c dông ®iÒu trÞ, cyclophosphamide cßn cã c¬ chÕ t¸c dông rÊt ®éc ®¸o vµ tÝnh chän läc trong ®iÒu trÞ. HiÖn nay cyclophosphamide lµ lo¹i thuèc chèng ung th− ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt trong ®iÒu trÞ ho¸ chÊt liÒu cao víi tæng liÒu l−îng dïng lµ 500 -700mg/m2 da ng−êi trong 1 ®Õn 4 ngµy. Lµ mét lo¹i ho¹t chÊt dÔ mÊt nit¬, cyclophosphamide ®ãng vai trß ankyl ho¸ ADN lµm cho ADN kh«ng th¸o rêi ®−îc, do vËy kh«ng t¹o thµnh ARN do ®ã dÉn tíi viÖc t¸i s¶n xuÊt tÕ bµo bÞ k×m h·m, tr−íc hÕt lµ ®èi víi 3 c¸c hÖ tÕ bµo ph¸t triÓn nhanh nh− c¸c tuyÕn tiÕt, da, tuû x−¬ng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c u ¸c tÝnh [1,2]. C¸c hîp chÊt cã tÝnh ankyl ho¸ sÏ tÊn c«ng vµo qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña a xÝt nucleic vµ k×m h·m sù ph¸t triÓn hoÆc tiªu diÖt nh÷ng tÕ bµo bÞ bÖnh. Tuy nhiªn, chóng còng tÊn c«ng c¶ tÕ bµo lµnh vµ ë liÒu hiÖu dông chóng còng cã ®éc tÝnh ®¸ng kÓ. Theo t¸c gi¶ Charlotte le Roux vµ céng sù th× c¬ chÕ alkyl ho¸ cña cyclophosphamide ®−îc lý gi¶i nh− sau [6]: O HO O P O P CH 2 Cl H 2N NH N CH2 CH2 Cl N -H + +H + O O P H 2N CH2 CH2 Cl N CH2 CH2 Cl CH 2 Cl CH2 CH2 Cl (A) Cyclophosphamide (I) - Cl O O P H 2N O CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Nu + Nu - O O - Cl - P H 2N (B) H 2N N CH 2 CH2 Nu O P CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Cl + Nu - O - O P H 2N N CH2 CH 2 Cl Trong c¬ thÓ cyclophosphamide gi¶i phãng ra chÊt phosphoramidat (A) mét t¸c nh©n alkyl ho¸ cã ho¹t tÝnh sinh häc. Ho¹t tÝnh sinh häc cña chÊt (A) ®−îc gi¶i thÝch qua d·y ph¶n øng bao gåm: ®ãng vßng néi ph©n tö; më vßng nucleophil. Qu¸ tr×nh nµy lÆp l¹i hai lÇn dÉn ®Õn s¶n phÈm cuèi cïng ®−îc alkyl ho¸ hai lÇn (B). Tuy nhiªn, c¬ chÕ chÝnh x¸c cña qu¸ tr×nh alkyl ho¸ cña chÊt (A) vÉn lµ vÊn ®Ò cßn Ýt ®−îc biÕt. C¸c b−íc theo tr×nh tù trªn bao gåm c¸c chÊt azinidin trung gian ®· ®−îc minh chøng b»ng c¸c thÝ nghiÖm ®¬tªr« ho¸. Nh−ng liÖu chÊt (A) sÏ tham gia ph¶n øng alkyl ho¸ nguyªn vÑn hay liªn kÕt P-N sÏ bÞ c¾t tr−íc khi alkyl ho¸ th× hiÖn vÉn cßn tranh c·i [6]. Theo nguyªn lý vÒ ''d¹ng vËn chuyÓn" (transport) vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh '' (active form) cña mét biÖt d−îc ®èi víi c¸c chÊt cã t¸c dông ankyl ho¸ th× mét ho¹t chÊt cÇn ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ë ''d¹ng vËn chuyÓn'' tøc lµ ë d¹ng ch−a cã ho¹t tÝnh. D¹ng nµy sÏ chuyÓn thµnh ''d¹ng ho¹t tÝnh'' trong c¬ thÓ vµ nÕu cã thÓ th× ngay t¹i vÞ trÝ 4 cÇn ®iÒu trÞ cã nghÜa lµ lµm t¨ng ®é chän läc cña thuèc. VÝ dô: §èi víi c¸c chÊt dÔ bÞ lo¹i nit¬ th× hîp chÊt chøa nhãm oxit nit¬ (N→O) lµ mét '' d¹ng vËn chuyÓn'' thùc thô. Nguyªn lý nµy ®· ®−îc ¸p dông víi lo¹i thuèc ch÷a ung th− tiÒn liÖt tuyÕn lµ stilbeoestroldiphosphate. Nh− ®· biÕt th× trong c¬ thÓ ng−êi bÖnh, t¹i bé phËn bÞ ung th− cã tån t¹i mét enzym d¹ng phosphamidasa vµ phosphatasa cã thÓ thuû ph©n ®−îc liªn kÕt phosphamide vµ este cña axit phosphoric. Víi ý t−ëng lµ: ®é chän läc cña thuèc sÏ t¨ng ®¸ng kÓ, nÕu ''d¹ng ho¹t tÝnh'' ®−îc t¹o thµnh trùc tiÕp t¹i vÞ trÝ cÇn ®iÒu trÞ, ng−êi ta ®· tæng hîp ra chÊt phosphamide este II ®Ó nghiªn cøu ®éng d−îc häc cña cyclophosphamide. Cl H2C NH N Cl H2C P R1 O O R2 II 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide Cyclophosphamide ®· ®−îc Arnold, Bourseaux vµ Hirsch [3,4] t×m ra lÇn ®Çu tiªn n¨m 1956 trong phßng nghiªn cøu cña nhµ m¸y Asta víi ký hiÖu lµ B518. ViÖc tæng hîp ra chÊt nµy lµ kÕt qu¶ cña sù mong muèn ¸p dông nguyªn lý ''d¹ng vËn chuyÓn" vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh ''. Cyclophosphamide ®−îc sö dông trong ®iÒu trÞ ung th− tõ n¨m 1958 hoÆc 1970 [1]. Ngoµi ra, cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông nh− mét chÊt øc chÕ miÔn dÞch ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh tù miÔn nh− nh−îc c¬, thÊp khíp, lupót ban ®á vµ ®Æc biÖt ®Ó chèng th¶i ghÐp trong c¸c ca ghÐp t¹ng [19, 24, 25]. Arnold, Bourseaux vµ Brock [7] ®· nghiªn cøu mèi quan hÖ gi÷a cÊu tróc vµ ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− cña hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ thu ®−îc ë chÊt cyclophosphamide lµ rÊt kh¶ quan vÒ mÆt d−îc lý vµ l©m sµng [4]. C¬ chÕ biÕn ®æi cña cyclophosphamide trong c¬ thÓ ®· ®−îc C.L. Roux vµ céng sù tiÕp tôc nghiªn cøu [6]. 5