Báo cáo " Khả Năng Chảy Nhớt, Cấu Trúc Và Tính Chất Cơ Lí Của Vật Liệu Compozit Polyvinyl Clorua/Nanoclay".pdf (Khả Năng Chảy Nhớt)

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH T p 44, s 2, 2006 Tr. 24-31 CHI T TÁCH, TINH S CH VÀ KH O SÁT TÁC D NG I KHÁNG VI SINH V T C A SALANIN T NHÂN H T CÂY XOAN N (Azadirachta indica A. juss) TR'NG T I VI(T NAM V V!N "#, NGUY&N TI(N TH)NG, NGUY&N TH* MINH, NGUY&N NG C H NH I. M� ��U Cây xoan �n �� còn g�i là cây neem (Azadirachta indica A. juss) h� Meliaceae ��c s� d�ng làm thu�c tr� sâu r�t có hi�u qu� � nhi�u nơi trên th� gi�i [6, 8, 10]. Hi�n nay các nhà khoa h�c �ã phân l�p hơn 60 ch�t limonoid có kh� n�ng gây ngán �n và xua �u�i côn trùng t� h�t và lá neem [1, 2, 3, 8, 9, 11]. � n��c ta, cây neem �ang ��c tr�ng nhi�u � các t�nh Nam Trung B� nh� Ninh Thu�n, Bình Thu�n �� ph� xanh vùng ��t cát c�n c�i và c�i t�o ��t b� hoang hóa nh� kh� n�ng ch�u h�n cao c�a cây. G�n �ây chúng tôi �ã báo cáo k�t qu� phân l�p azadirachtin, m�t limonoid chính c�a nhân h�t neem tr�ng t�i Ninh Thu�n [12]. Trong bài này, chúng tôi trình bày ph�ơng pháp phân l�p và xác ��nh c�u trúc salanin, kh�o sát ho�t tính gây ��c t� bào và kh� n�ng kháng vi sinh v�t ki�m ��nh c�a salanin. II. NGUYÊN LI�U VÀ PH�ƠNG PHÁP 1. Nguyên li�u H�t neem (Azadirachta indica A. juss) ��c thu t�i khu r�ng neem tr�ng t�i huy�n Ninh Ph��c, t�nh Ninh Thu�n vào tháng 7 n�m 2003, t� nh�ng cây 4 - 5 n�m tu�i. 2. Ph��ng pháp và thi�t b� -Ph� h�ng ngo�i (IR) ��c �o trên máy VECTOR 22, dùng viên nén KBr. -Ph� kh�i l��ng ��c �o trên thi�t b� 1100 series LC/ MSD Trap, Agilent. -Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân ��c �o trên máy Bruker Avance 500 MHz. �� d�ch chuy�n hóa h�c ��c tính theo �ppm so v�i TMS, h�ng s� t�ơng tác (J) tính b�ng Hz. mm. -Phân tích s�c kí l�p m�ng trên b�n nhôm Silicagel Merck 60 F254 tráng s�n có �� dày 0,2 - S�c kí c�t s� d�ng silicagel Merck c� h�t 0,04 mm - 0,063 mm. - S�c kí l�ng cao áp (HPLC) s� d�ng ��u dò DAD, c�t Bondapack, C18, 3,9 × 300 mm. - �i�m nóng ch�y ��c �o trên máy Electrothermal IA 9000 series, dùng mao qu�n không hi�u ch�nh. - Tác ��ng ��i kháng vi sinh v�t và gây ��c t� bào ��c th� t�i phòng thí nghi�m th� ho�t tính sinh h�c - Vi�n Hóa h�c các h�p ch�t thiên nhiên, Hà N�i. III. K�T QU� VÀ TH�O LU�N 1. Chi�t tách và phân l�p salanin 24 H�t neem thu ��c, sau khi lo�i b� h�t v� và ph�n th�t qu�, ��c s�y ��n khô � 50oC. 5 kg nhân h�t �em li trích v�i ete d�u h�a (40 - 60oC) b�ng b� chi�t Soxhlet. Sau khi lo�i dung môi ete d�u h�a, thu ��c 970 g c�n d�u s�t, màu vàng nâu. H�n h�p d�u ��c ti�p t�c hòa tan trong methanol (MeOH). Lo�i dung môi methanol, thu ��c 230 g c�n s�t màu vàng s�m. C�n tan trong methanol cho ch�y s�c kí c�t nhanh v�i h� dung môi là ete d�u h�a và chloroform v�i �� phân c�c t�ng d�n. Ki�m tra các phân �o�n thu ��c sau s�c kí c�t b�ng s�c kí b�n m�ng �� gom các phân �o�n có Rf gi�ng nhau. Ti�p t�c s�c kí c�t l�n 2 v�i các phân �o�n giàu salanin thu ��c � trên, chúng tôi thu ��c 120 mg tinh th� hình l�ng tr� không màu, kí hi�u MS. B ng 1. Ph� 1H - NMR và 13C - NMR c�a ch�t MS trong dung môi CDCl3, �ppm V� trí H [500 MHz, J(Hz)] C (125 MHz) 1 4,96 t, j = 3 71,37 2 2,31 m 27,62 3 4,78 t, j = 3 71,37 4 42,75 5 2,81 d, j = 12,5 39,46 6 3,99 dd, j = 3; 12 72,65 7 4,18 d, j = 3 85,72 8 9 49,12 2,75 dd, j = 4; 8 10 11 39,98 40,65 2,22 m 30,72 12 172,80 13 134,89 14 146,60 15 5,44 m 87,93 16a 16b 2,13 d, j = 12 2,25 d, j = 12 41,43 17 3,64 d, j = 3,5 49,46 18 1,67 s 13,14 19 0,98 s 15,14 20 127,13 21 7,32 t, j = 1,5 142,94 22 6,29 m 110,63 25 23 28a 28b 7,26 3,69 3,59 138,83 d, j = 3 77,70 29 1,22 s 19,63 30 1,30 s 16,93 OCH3 3,26 s 51,49 1’ 170,40 2’ 129,09 3’ 137,24 4’ 1,82 d, j = 1 14,35 41,43 5’ 6’ 1,94 s 1,94 s 11,92 20,87 2. Xác ��nh c�u trúc MS có các ��c tính sau: - �i�m nóng ch�y: Mp = 156oC (Hexan - Ete etilic) - Ph� h�ng ngo�i: Vmax (cm-1): 2953, 1727, 1701, 1650, 1483, 1264, 1141, 1054. - Ph� kh�i l��ng: 619 [M + Na]+. - Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân 1H - NMR và 13C - NMR ��c �o trong dung môi CDCL3 và �� d�ch chuy�n hóa h�c �ppm ��c trình bày � b�ng 1. - Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân 2 chi�u 1H - 1H - COSY và HMBC ��c trình bày � b�ng 2, hình 1 và hình 2. B ng 2. S� t�ơng tác 1H - 1H - COSY và HMBC c�a ch�t MS Vò trí COSY HMBC 1 H1 – H2 C10, C9 2 H2 – H1 ; H2 – H3 C5 3 H3 – H2 4 5 H5 – H6 6 H6 – H5 ; H6 – H7 7 H7 – H6 8 9 26 H9 – H11 C19, C29, C10, C4, C1, C3, C7 10 11 H11 – H9 C12 12 13 14 15 H15 – H16a ; H15 – H16b 16a 16b H16 – H15 H16 – H17 C20 17 H17 – H16 C20, C13, C23, C14, C15, C2, C8 18 C8 K�t qu� nh�n ��c cho th�y: - Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân 1H – NMR cho th�y các proton c�a vòng furan có �ppm là 7,32; 6,29 và 7,26 t�ơng �ng v�i v� trí H-21, H-22 và H-23, m�t nhóm CH3- có m�i �ôi � v� trí 4’ (b�ng 1). - Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân hai chi�u COSY cho th�y rõ s� t�ơng tác c�a H1 – H2, H2 – H3, H5 – H6… (hình 1 và b�ng 2). - Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân hai chi�u HMBC cho th�y có s� t�ơng tác xa c�a H1 v�i C9 – C10, ��c bi�t � v� trí H5 t�ơng tác v�i carbon � v� trí 19, 29, 10, 4, 1, 3 và 7 (hình 2 và b�ng 2). Hình 1. Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân hai chi�u 1H - 1H - COSY c�a MS 27 Hình 2. Ph� c�ng h��ng t� h�t nhân hai chi�u HMBC c�a MS D�a vào phân tích ph� c�ng h��ng t� h�t nhân 2 chi�u và so sánh v�i các tài li�u �ã công b� [4, 6], ch�t MS ��c xác ��nh chính là salanin có c�u trúc nh� sau: H3C O 5' 2' O 3' H3C 6' H3C 4' O 11 12C 2 O 1 O 13 17 D 9 10 5 4 8 6 7 23 18 30 19 3 C 22 OCH3 1' O 20 21 16 15 O H 29 28 O �ây là l�n ��u tiên, salanin ��c kh�o sát c�u trúc b�ng ph� 1H - 1H - COSY và ph� HMBC. 3. Xác ��nh kh� n�ng gây ��c t� bào ng��i Kh� n�ng gây ��c t� bào ��c th� nghi�m theo ph�ơng pháp hi�n �ang ��c ti�n hành t�i vi�n nghiên c�u ung th� Qu�c gia c�a M�. Các dòng t� bào ung th� ng��i: Hep - G2 (ung th� gan), Fl (ung th� màng t� cung), RD (ung th� màng tim). T� bào ung th� ��c duy trì liên t�c � các �i�u ki�n tiêu chu�n và ��c s� d�ng th� v�i các ch�t th� �ã ��c chu�n b� s�n � các n�ng �� khác nhau trên phi�n vi l��ng 96 gi�ng, phi�n th� nghi�m bao g�m: t� bào, môi tr��ng nuôi c�y và ch�t th�, ��c � � 37oC �� t� bào ti�p t�c phát tri�n. Sau �ó t� bào ��c l�y ra c� ��nh, r�a, nhu�m và hòa l�i b�ng dung d�ch chu�n, ��c trên máy Elisa � b��c sóng 515 - 540 nm. K�t qu� th� nghi�m ��c tính t� bào c�a ch�t MS bi�u hi�n b�ng s� t� bào s�ng sót (%), ��c ghi nh�n � b�ng 3. 28 B ng 3. Kh� n�ng gây ��c t� bào c�a MS STT Kí hi�u m�u 1 S� t� bào s�ng sót (%) Hep-G2 F1 RD DMSO* 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 2 Ch�ng (+)** 1,5 ± 0,09 1,05 ± 0,6 2,5 ± 0,02 3 MS 101,8 ± 1,1 102,8 ± 2,5 68,7 ± 1,5 * DMSO [Dimethyl sulfoxide, (CH3)2SO)]: Dung d�ch không, dùng làm ��i ch�ng tr�ng trong thí nghi�m; ** Ch�ng(+): S� d�ng thu�c tr� ung th� ��c hi�u. Các k�t qu� nh�n ��c � trên cho th�y MS không gây ��c ��i v�i 3 dòng t� bào Fl, RD và Hep-G2. 4. Xác ��nh tính ��i kháng vi sinh v�t Ho�t tính ��i kháng vi sinh v�t ��c th�c hi�n theo 2 b��c: B c 1: Th� ��nh tính theo ph�ơng pháp khu�ch tán trên th�ch, s� d�ng khoanh gi�y l�c t�m ch�t th� theo n�ng �� tiêu chu�n. Các ch�ng vi sinh v�t ki�m ��nh g�m ��i di�n các nhóm sau: - Vi khu�n Gr (-): E. coli, P. aeruginosa. - Vi khu�n Gr (+): B. subtillis, S. aureus. - N�m m�c: Asp. niger, F. oxysporum. - N�m men: C. albicans, S. cerevisiae. B c 2: Các m�u cho ho�t tính d�ơng � b��c 1 s� ��c ti�n hành th� ti�p b��c 2 �� tính ra n�ng �� c ch� t�i thi�u (MIC) theo ph�ơng pháp c�a Vanden Bergher và Vlietlink (1994) ti�n hành trên phi�n vi l��ng 96 gi�ng. Kháng sinh ki�m ��nh bao g�m: Ampicilin, Tetracycline, Nystatin. + M�u thô có giá tr�: MIC <= 200 �g/ ml, ��c coi là d�ơng tính kháng vi sinh v�t. + M�u tinh có giá tr�: MIC <= 50 �g/ ml, ��c coi là d�ơng tính kháng vi sinh v�t. K�t qu� xác ��nh ho�t tính ��i kháng vi sinh v�t ki�m ��nh c�a MS ��c trình bày � b�ng 4. B ng 4. K�t qu� xác ��nh ho�t tính ��i kháng vi sinh v�t ki�m ��nh c�a MS Kí hi�u m�u N�ng �� c ch� t�i thi�u MIC ( µg/ ml) Vi khu�n Gr(-) MS E. coli (_) Vi khu�n Gr(+) P. B. aeruginosa substillis (_) 25 N�m m�c N�m men S. aureus Asp. niger Asp. oxysporum C. albicans S. cerevisiae (_) 12,5 25 12,5 25 29 K�t qu� nh�n ��c cho th�y MS có ho�t tính ��i kháng 5 vi sinh v�t ki�m ��nh, ��c bi�t kháng m�nh A. niger và C. albicans. IV. K�T LU�N T� nhân h�t neem tr�ng t�i Ninh Thu�n chúng tôi �ã phân l�p salanin � d�ng tinh khi�t và kh�o sát c�u trúc b�ng các ph�ơng pháp ph� hi�n ��i, ��c bi�t là ph� c�ng h��ng t� h�t nhân 2 chi�u COSY và HMBC c�a salanin ��c công b� l�n ��u tiên � Vi�t Nam. Salanin ��c kh�o sát ho�t tính gây ��c t� bào ng��i và ho�t tính ��i kháng vi sinh v�t ki�m ��nh. K�t qu� cho th�y salanin không có tác d�ng gây ��c t� bào ng��i nh�ng l�i có ho�t tính kháng 5 vi sinh v�t ki�m ��nh, ��c bi�t kháng m�nh ��i v�i A. niger và C. albicans. TÀI LI�U THAM KH�O 1. Bina S. Siddiqui and Munawwer Rasheed - Three new triterpenoids from Azadirachta indica, Helvetica Chimica Acta 84 (2001) 1962-1968. 2. Bina S. Siddiqui, Syed Tariq Ali, Munawwer Rasheed and Muhammad Nadeem Kardar Chemical constituents of the flowers of Azadirachta indica, Helvetica Chimica Acta 86 (2003) 2787-2796. 3. S. P. Basak and D. P. Chakraborty - Chemical investigation of Azadirachta indica leaves, Journal of the Indian Chemical Society 45 (1968) 466-467. 4. R. Bryan Yamasaki, Thomas G. Ritland, Marka, Barnby, and James. A. Kloc - Isolation and purification of salanin from neem seeds and its quantification in neem and chinaberry seeds and leaves, (1988) 277-283. 5. De Silva, L. B., W. Stocklin and T. A. Geissman - The isolation of salanin from Melia dubia. Phytochemistry 8 (1969) 1817-1819. 6. H. S. Garg and D. S. Bhakuni - Salanoide, a meliacin from Azadirachta indica seed (neem oil), Journal of Ethnopharmacology 23 (1981) 39-51. 7. R. Henderson, R. Mc Crindle, A. Melera, and K. H. Overton - Tetranortriterpenoids - I. The constitution and stereochemistry of salanin, Tetrahedron 24 (1967) 1525-1528. 8. M. Jacobson - Review of neem research in the United States, In : Locke, J. C. and Lawson, R. H (Eds.), Proceeding of a workshop on neem potential in pest management, 1990. 9. W. Krans, M. Bokel, A. Klenk, and H. Pohnl - The structure of azadirachtin and 22, 23 dihydro - 23 -ß – methocyazadirachtin, Tetrahedron letters (1985) 6435-6438. 10. H. Schmuttere, H. Properties and potential of natural pestisides from the neem tree, Azadirachta indica. Ann. Rev. Entomol. 35 271-290. 11. S. Siddiqui, T. Mahmood, B. S. Siddiqui, and S. Faizi - Isolation of triterpenoid from Azadirachta indica. Phytochemistry 25 (1986) 2183-2185. 12. V� V�n ��, Nguy�n Ti�n Th�ng - Chi�t xu�t, tinh s�ch và xác ��nh hàm l��ng c�a azadirachtin trong h�t neem, T�p chí Sinh h�c 27 (2) (2005) 57-60. 30 SUMMARY ISOLATION, PURIFICATION AND INVESTIGATION ON ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SALANIN FROM NEEM SEED KERNEl (Azadirachta indica A. juss) OF THE NEEM TREE PLANTED IN NINH THUAN PROVINCE, VIET NAM From the seed of the neem tree (Azadirachta indica A. juss), collected from Ninh Thuan province. For the first time, Salanin have been isolated, characterized and determinded molecular structure by spectroscopic analysis such as IR, MA, 1H - NMR, 13C - NMR, COSY, HMBC. Salanin showed antimicrobial activity against B. subtillis, Asp. niger, F. oxysporum, C. albicans and S. cerevisiae. But, it was harmless for human cells. *+a ch,: Nh.n bài ngày 9 tháng 4 n2m 2005 V� V�n ��, Nguy�n Ti�n Th�ng, Vi�n Sinh h�c nhi�t ��i, Vi�n Khoa h�c và Công ngh� Vi�t Nam. Nguy�n Th� Minh, Nguy�n Ng�c H�nh, Vi�n Công ngh� hóa h�c, Vi�n Khoa h�c và Công ngh� Vi�t Nam. 31

Báo cáo " Khả Năng Chảy Nhớt, Cấu Trúc Và Tính Chất Cơ Lí Của Vật Liệu Compozit Polyvinyl Clorua/Nanoclay"

Nội dung