Nội dung

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: VACCINE VÀ ỨNG DỤNG. BÀI TIỂU LUẬN NHÓM Môn: Sinh Lý Người Và Động Vật Giảng viên hướng dẫn: Ths: Lại Đình Biên TP.HCM, Tháng 5 năm 2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: VACCINE VÀ ỨNG DỤNG. BÀI TIỂU LUẬN NHÓM Môn: Sinh Lý Người Và Động Vật Giảng viên hướng dẫn: Ths. Lại Đình Biên Nhóm sinh viên thực hiện: 1. Nguyễn Tuấn Vũ 2. Bùi Văn Sự 3. Huỳnh Ngọc Quang 4. Nguyễn Trần Anh Thư 5. Phạm Đỗ Thảo Vy 6. Nguyễn Lê Hoàng Dung 3008140440 3008140170 3008140018 3008140260 3008140202 3008140292 TP.HCM, Tháng 5 năm 2016 LỜI CẢM ƠN Chúng tôi xin trân thành cảm ơn Ths. Lại Đình Biên đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian học tập.Một lần nữa nhóm chúng tôi xin trân thành cảm ơn thầy. Mặc dù bài tiểu luận đã hoàn thành nhưng khó tránh những sai sót.Mong rằng sẽ nhận được đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để bài tiểu luận hoàn thiện hơn. Từ đó, chúng tôi sẽ có thêm nhiều kinh nghiệm để thực hiện những bài tiều luận tiếp theo cũng như đồ án sau này và nghề nghiệp tương lai. Sau cùng chúng tôi xin chúc Ths. Lại Đình Biên và toàn thể các thầy cô trong Khoa thật dồi dào sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức của mình cho thế hệ mai sau. Trân trọng cảm ơn! NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN i LỜI CAM ĐOAN Chúng tôi những người thực hiện bài tiểu luận này xin cam đoan: Bài tiểu luận do các thành viên trong nhóm cùng chung tay làm việc, có sự phân công rõ ràng và công bằng giữa các thành viên trong nhóm. Đồng thời, không sao chép bất cứ bài tiểu luận của bất kì ai. Các nội dung trong đây đã được tham khảo kỉ lưỡng trước khi đưa vào bài tiều luận. Chúng tôi sẽ chịu hoàn toàn trách nhiệm trước thầy và Khoa về những cam đoan này. TP.HCM, ngày 2 tháng 5 năm 2016 NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN ii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch. ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay. HAV Hepatitis A Virus (Virus viêm gan A). HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HBsAg viêm gan B). Hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt viru1t PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuổi polymerase). WSV Working seed virus (chủng sản xuất). PFU Plaque Forming Unit ( đơn vị tạo đám hoại tử). PMMK Primary Monkey Kidney Cell (tế bào thận khỉ tiên phát). MSV Master seed virus (chủng gốc giống). AGMK cell African green monkey kidney cell (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi tiên phát) BS-C-1 Tế bào thận khỉ Châu phi thường trực. Frhk-4 Tế bào thận khỉ Rhesus bào thai thường trực. iii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ STT 1 2 3 4 5 6 Tên bảng và sơ đồ Bảng 2.1: Lịch tiêm chủng các vacxin trong chương trình tiêm chủng mở rộng ở Việt Nam: Sơ đồ 3.1: Quy trình sản xuất vacxin truyền thống. Sơ đồ 3.2: Sơ đồ cấy truyền virus HAV- HM- 175 qua tế bào của các loài khác nhau. Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích và xác định gen đích Sơ đồ 3.4: Các chu kì của kỉ thuật PCR Sơ đồ 3.5: Quy trình nuôi cấy tế bào đích trên vi khuẩn E. Coli iv Trang 21 23 24 26 27 28 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH STT Tên các hình 1 Hình 1.1: Edward Jenner (bên trái) và Louis Pasteur (bên phải) Hình 1.2: Virus variola tác nhân gây dđậu mùa bò (trái) và hình 2 Jenner đang tiêm chủng cho người (phải). Hình 1.3: Vacxin bệnh đậu mùa bò (trái) và Ali Maow Maalin 3 (phải) Hình 1.4: Vacxin BCG- ngừa lao (trái) và vacxin Rota ngừa bại 4 liệt (phải). 5 Hình 1.5: Cơ chế bảo vệ cơ thể của miễn dịch đặc hiệu. 6 Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của vacxin. 7 Hình 1.7: Biểu hiện sốt nhẹ và xuất hiện mẫn đỏ khi tiêm vacxin. Hình 1.8: Nghiên cứu vacxin trong phòng thí nghiệm và thử 8 nghiệm trên khỉ. Hình 1.9: Vacxin bại liệt bất hoạt (IPV) (trái) và vacxin phòng 9 bệnh dại LYSSAVAC N (phải) Hình 1.10: Vacxin sởi giảm độc lực MVVAC (trái) và vacxin 10 thủy đậu giảm độc lực Varilrix (phải). Hình 1.11: Vacxin uốn ván hấp phụ VAT (trái) và vacxin giải độc 11 tố bạch hầu, uốn ván Td (phải) Hình 1.12: Vaccin phối hợp phòng bệnh sởi-quai bị-rubella 12 MMR II và Trimovax Hình 1.13: Cấu trúc virus viêm gan B và vacxin phòng viêm gan 13 B thế hệ 2. Hình 1.14: Vacxin phòng bệnh viêm gan B r-Hbvax và vacxin 14 Cúm INFLUVAC thế hệ III 15 Hình 2.1: Một số hình thức đưa vacxin vào cơ thể. 16 Hình 2.2: Một số thiết bị bảo quản vacxin. 17 Hình 2.3: Tiêm chủng vaccin 18 Hình 3.1: Cấu trúc virus viêm gan A 19 Hình 3.2: Vacxin viêm gan A Hình 3.3: Hình dưới kính hiển vi và cấu trúc của virus viêm gan 20 B. 21 Hình 3.4: Một số hệ thống lên men vi sinh vật. 22 Hình 3.5: Vacxin viêm gan B 23 Hình 3.6: Quy trình sản xuất một vacxin ADN. v Trang 2 3 4 5 6 6 7 8 10 10 11 12 13 14 16 17 18 24 26 29 30 31 33 MỤC LỤ LỜI CẢM ƠN........................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................ii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT..................................................................iii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ...............................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH...........................................................................v I. Giới thiệu...........................................................................................................2 1.1 Lịch sử phát triển của vaccine...................................................................2 1.2 Vaccine........................................................................................................4 1.2.1 Cơ sở lý thuyết......................................................................................4 1.2.2 Định nghĩa............................................................................................5 1.2.3 Cơ chế hoạt động của vaccine..............................................................5 1.2.4 Đặc tính của vaccine............................................................................7 1.2.4.1. An toàn.........................................................................................7 1.2.4.2. Hiệu lực........................................................................................8 1.2.4.3. Tính kháng nguyên hay tính kháng thể........................................9 1.2.4.4. Tính miễn dịch hay tính mẫn cảm................................................9 1.3 Phân loại vaccine........................................................................................9 1.3.1 Vacxin thế hệ thứ nhất..........................................................................9 1.3.2 Vacxin thế hệ thứ hai..........................................................................12 1.3.3 Vacxin thế hệ thứ ba...........................................................................13 1.3.4 Dạng kháng - kháng thể vacxin..........................................................15 II. Ứng dụng của vaccine....................................................................................15 2.1 Nguyên lý sử dụng vaccine........................................................................15 2.1.1 Liều lượng và đường đưa vaccin vào cơ thể......................................15 2.1.2 Bảo quản vaccin.................................................................................17 2.1.3 Đối tượng tiêm chủng.........................................................................17 2.2 Vaccine ứng dụng trong thực tế................................................................19 2.2.1 Các loại vacxin thế hệ 1.....................................................................19 2.2.2 Các loại vacxin thế hệ 2 và 3.............................................................22 III. Sản xuất vacxin.............................................................................................22 3.1 Sản xuất vacxin truyền thống....................................................................22 3.1.1 Quy trình sản xuất chung...................................................................22 3.1.2 Vacxin được sản xuất.........................................................................23 3.2 Sản xuất vacxin thế hệ mới – Vacxin ADN tái tổ hợp...............................26 3.2.1 Quy trình sản xuất chung...................................................................26 3.2.2 Vacxin được sản xuất.........................................................................28 3.3 Vaccine đang nghiên cứu..........................................................................32 IV. Hạn chế của vacxin.......................................................................................33 4.1 Kém hiệu quả.............................................................................................33 4.1.1 Kém hiệu quả về lượng.......................................................................33 4.1.2 Kém hiệu quả về chất.........................................................................34 4.2 Tai biến......................................................................................................34 4.2.1 Nhiễm bệnh.........................................................................................34 4.2.2 Các bệnh miễn dịch............................................................................34 V. Kết luận..........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................36 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường LỜI MỞ ĐẦU Vacxin là một công cụ rất hiệu quả trong dự phòng các bệnh nhiễm trùng. Hiện nay đã có gần 30 bệnh nhiễm trùng có thể dự phòng được bằng vắc xin. Không giống như các can thiệp y tế khác, vacxin giúp cho dự phòng và bảo vệ sức khỏe cho con người và qua đó góp phần phát triển nguồn nhân lực. Ngoài việc làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong, làm cho trẻ em khỏe mạnh phát triển thể chất và trí não bình thường, vacxin còn giảm mắc các bệnh khác, giảm số ngày ốm và nhập viện, giảm chi phí chăm sóc y tế, đặc biệt giảm thời gian và công sức của phụ nữ do không phải chăm sóc trẻ bị bệnh cũng như làm giảm số trẻ sinh ra do không phải lo trẻ bị ốm và chết, góp phần nâng cao sức khỏe của phụ nữ, giảm tình trạng tàn phế hay mất khả năng lao động do bệnh tật gây nên. Ngoài ra tiêm chủng còn giúp bảo vệ sức khỏe cho cả người lớn như vắc xin phòng cúm, phòng viêm màng não do não mô cầu, phòng ung thư gan, ung thư cổ tử cung. Bên cạnh những ích lợi trực tiếp và gián tiếp của vacxin trong việc làm giảm tỷ lệ mắc và tử vong của các bệnh nhiễm trùng, nó còn có những tác động lâu dài cho cá nhân và cộng đồng, như tăng khả năng và năng suất lao động do không bị ốm đau. Chính vì những lợi ích to lớn mà vacxin mang lại mà nhóm chúng tôi chon đề tài “ Vacxin và ứng dụng” để tìm hiểu sâu hơn cụ thể hơn về vacxin cũng như những gì mà ch1ng mang lại cho con người. Bài báo cáo này gồm 5 phần và được trình bày cụ thể như sau:  Phần I: Giới thiệu: Phần này chúng tôi sẽ khái quát những gì cơ bản nhất về vacxin.  Phần II: Ứng dụng của vacxin: Trong phần này nhóm sẽ tìm hiểu khái quát những ứng dụng cơ bản của vacxin trong đời sống.  Phần III: Sản xuất vacxin: Trong phần này nhóm sẽ trình bày quy trình sản xuất của 2 loại vacxin cơ bản là vacxin truyền thống và vacxin ADN tái tổ hợp và đi sâu vào nghiên cứu cách sản xuất 2 loại vacxin viêm gan A và B.  Phần IV: Hạn chế của vacxin: Phần này nhóm sẽ trình bày những yếu kém mà vacxin mang lại cho con người.  Phần V: Kết luận: Đánh giá lại toàn bộ những gì nhóm đã tìm hiểu. Biển học là vô bờ, do đó còn nhiều điều còn chưa đề cập đến hay còn sai sót chắc chắn là không thể tránh khỏi. Rất mong nhận được sự đóng góp từ Ths. Lại Đình Biên cũng như các thầy cô trong Khoa, để các bài báo cáo, luận sau này có thể hoàn thiện hơn tránh những sai lầm không đáng có. Cuối cùng, xin chúc Ths. Lại Đình Biên và quý thầy cô thật dồi dào sức khỏe và luôn thành công trong công việc. Xin trân thành cảm ơn ! Trang 1 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN Trang 2 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường I. Giới thiệu 1.1 Lịch sử phát triển của vaccine. Edward Jenner (1749-1823) được công nhận là người đầu tiên dùng vaccine để ngừa bệnh cho con người ngay từ khi người ta còn chưa biết bản chất của các tác nhân gây bệnh (năm 1796). Louis Pasteur (1822-1895) với các công trình nghiên cứu về vi sinh học và miễn dịch học đã mở đường cho những kiến thức hiện đại về vaccine. Hình 1.1: Edward Jenner (bên trái) và Louis Pasteur (bên phải) Ở Trung Quốc, vào khoảng thế kỷ thứ 10, các thầy lang Đạo giáo đã bí mật dùng một kỹ thuật phòng bệnh đậu mùa. Đậu mùa là chứng bệnh hiểm nghèo, nếu không giết chết bệnh nhân thì nó cũng để lại những vết sẹo rỗ trên mặt. Các thầy lang đã lấy vẩy sẹo của người bị bệnh(chứa mầm bệnh), cho vào một chiếc hộp kín rồi giữ ở nhiệt độ nhất định trong một thời gian để giảm độc tính, sau đó nghiền nhỏ thổi vào mũi của người khỏe chưa từng mắc bệnh đậu mùa để ngừa bệnh. Một phương pháp tương tự cũng được dùng ở Thổ Nhĩ Kỳ vào thế kỷ 18. Bỏ qua những huyền thoại lẻ loi và không chắc chắn trên, vaccine đầu tiên gắn với tên tuổi của Edward Jenner, một bác sĩ người Anh. Năm 1796, châu Âu đang có dịch đậu mùa, Jenner đã thực hiện thành công thử nghiệm vaccin ngừa căn bệnh này. Kinh nghiệm dân gian cho thấy những nông dân vắt sữa bò có thể bị lây bệnh đậu bò, nhưng sau khi khỏi bệnh, họ trở nên miễn nhiễm đối với bệnh đậu mùa. Dựa vào đó, Jenner chiết lấy dịch từ các vết đậu bò trên cánh tay của cô bệnh nhân Sarah Nelmes Trang 3 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường rồi cấy dịch này vào cánh tay của cậu bé 8 tuổi khỏe mạnh cùng làng tên là James Phipps. Sau đó Phipps đã có những triệu chứng của bệnh đậu bò. 48 ngày sau, Phipps khỏi hẳn bệnh đậu bò, Jenner liền tiêm chất có chứa mầm bệnh đậu mùa cho Phipps, nhưng Phipps không hề mắc căn bệnh này. Cách làm của Jenner xét theo các tiêu chuẩn y đức ngày nay thật không ổn, nhưng rõ ràng đó là một hành động có tính khai phá: đứa trẻ được chủng ngừa đã đề kháng được bệnh. Thời của Jenner, các virus vẫn chưa được khám phá, còn vi khuẩn tuy đã được tìm ra nhưng vai trò gây bệnh của chúng chưa được biết. Thời điểm 1798, khi Jener công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm bệnh" gây nên sự truyền nhiễm Sau thí nghiệm thành công của Jenner, phương pháp chủng đậu được triển khai rộng rãi. Tính đến năm 1801, ở Anh đã có trên 100.000 người được chủng. Hình 1.2: Virus variola tác nhân gây dđậu mùa bò (trái) và hình Jenner đang tiêm chủng cho người (phải). Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả khi dịch tả đang tàn sát đàn gà. Ông cấy các vi khuẩn tả trong phòng thí nghiệm rồi đem tiêm cho gà: những con bị tiêm chết sạch. Mùa hè năm 1878, ông chuẩn bị một bình dung dịch nuôi cấy vi khuẩn dạng huyền phù, rồi để đó, đi nghỉ mát. Khi trở về, ông lại trích lấy huyền phù đó đem tiêm cho gà. Lần này thì bầy gà chỉ bị bệnh nhẹ rồi cả đàn cùng khỏe lại. Pasteur hiểu ra rằng khi ông đi vắng, đám vi khuẩn trong huyền phù đó đã bị biến tính, suy yếu đi. Ông bèn lấy vi khuẩn tả (bình thường) đem tiêm cho những con gà vừa trải qua thí nghiệm trên và những con chưa hề bị chích vi khuẩn. Kết quả là những con nào từng được chích vi khuẩn (biến tính) thì có khả năng đề kháng lại mầm bệnh, bọn còn lại chết hết. Qua đó, Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại. Từ đó, chủng ngừa đã đẩy lùi nhiều bệnh: triệt tiêu bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho Trang 4 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường gà, bệnh ban đào, thủy đậu, quai bị, thương hàn và uốn ván v.v. Nguyên tắc vẫn không có gì thay đổi: gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một proteinđặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính. Người ta còn hướng tới triển vọng dùng vaccine để điều trị một số bệnh còn nan y như ung thư, AIDS v.v. Tuy nhiên, nhiều bệnh vẫn còn đang thách thức con người, chưa có e nào đủ hiệu quả để ngăn ngừa. Trong đó phải kể nhiều bệnh do ký sinh trùng (thí dụ sốt rét, giun, sán), vi khuẩn (lao), virus (cúm, sốt xuất huyết, AIDS v.v.). Một số lý do có thể là các tác nhân gây bệnh biến đổi thường xuyên khiến cho miễn dịch không còn hữu hiệu hoặc thậm chí tấn công ngay vào hệ miễn dịch như trường hợp của HIV v.v. (Đã có lúc bệnh lao được đẩy lùi bằng nhiều biện pháp phối hợp (thuốc, vaccine và các biện pháp phòng ngừa khác), nhưng sự xuất hiện của AIDS đã làm cho dịch lao có dịp bùng phát, nhất là tại các nước đang phát triển.) Lần đầu tiên trong lịch sử, con người đã thanh toán được một căn bệnh hiểm nghèo. Ảnh chụp năm 1977, Ali Maow Maalin, người Somalia, được xem là bệnh nhân cuối cùng mắc bệnh đậu mùa. Hình 1.3: Vacxin bệnh đậu mùa bò (trái) và Ali Maow Maalin (phải) 1.2 Vaccine 1.2.1 Cơ sở lý thuyết. Bất kỳ một chất nào khi đưa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp gây ra đáp ứng miễm dịch đều được gọi là chất sinh miễn dịch. Bất cứ chất nào khi gắn với thành phần đáp ứng miễn dịch ( kháng thể hoặc tế bào lympho hoặc cả hai) đều được gọi là kháng nguyên. ( nghĩa là các chất khi đưa Trang 5 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo nên kháng thể . Vacxin được xem là một chất sinh miễn dịch vì bản thân nó mang kháng nguyên có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Hệ miễn dịch nhận diện vacxin là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho ghi nhớ- memory cell). Đây chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. 1.2.2 Định nghĩa. Vacxin là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân gây bệnh cụ thể. Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vacxin để điều trị một số bệnh (vacxin liệu pháp, một hướng trong các miễn dịch liệu pháp). Thuật ngữ vaxcin xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái"). Việc dùng vaccin để phòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vaccin không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua đường miệng. Hình 1.4: Vacxin BCG- ngừa lao (trái) và vacxin Rota ngừa bại liệt (phải). 1.2.3 Cơ chế hoạt động của vaccine. Hệ miễn dịch nhận diện vaccin là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho ghi nhớ). Đây chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Trang 6 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Hình 1.5: Cơ chế bảo vệ cơ thể của miễn dịch đặc hiệu. Vacxin gồm 2 thành phần chính: Kháng nguyên: là thành phần chính của vacxin – là cơ chất hóa học có khả năng gây ra cho cơ thể sự trả lời miễn dịch. Chất bổ trợ: là những chất được bổ sung vào vacxin, có khả năng kích thích sinh miễn dịch không đặc hiệu nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch của vaccine. Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của vacxin. Trang 7 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường 1.2.4 Đặc tính của vaccine. 1.2.4.1. An toàn Một vacxin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và không gây phản ứng. Sau khi sản xuất vacxin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và không độc.  Vô trùng: Vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác, nhất là các vi sinh vật gây bệnh.  Thuần khiết: Ngoài kháng nguyên đưa vào để kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác có thể gây ra các phản ứng phụ bất lợi  Không độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc. Tuy nhiên, không có vacxin nào đạt được độ an toàn tuyệt đối. Về nguyên tắc, vacxin phải đảm bảo đủ độ an toàn. Song trên thực tế không thể đạt được mức độ an toàn tuyệt đối. Tất cả các vacxin đều có thể gây ra phản ứng phụ ở một số người. Một số phản ứng khi tiêm vaccine:  Phản ứng tại chỗ: Những phản ứng nhẹ thường gặp sau tiêm chủng là nơi tiêm có thể hơi đau, mẩn đỏ, hơi sưng hoặc nổi cục nhỏ. Những phản ứng này sẽ mất đi nhanh chóng sau một vài ngày, không cần phải can thiệp gì. Nếu tiêm chủng không đảm bảo vô trùng, thì nơi tiêm chủng có thể bị viêm nhiễm, làm mủ.  Phản ứng toàn thân: Trong các phản ứng toàn thân, sốt hay gặp hơn cả, khoảng từ 10 đến 20 %. Sốt thường hết nhanh sau một vài ngày. Co giật có thể gặp nhưng với tỷ lệ rất thấp, khoảng 1 phần vạn, hầu hết khỏi không để lại di chứng gì. Một số vacxin có thể gây ra phản ứng nguy hiểm hơn, trong đó có sốc phản vệ, tuy nhiên rất hiếm gặp. Hình 1.7: Biểu hiện sốt nhẹ và xuất hiện mẫn đỏ khi tiêm vacxin. Trang 8 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Khi bàn về những phản ứng do vacxin, rất cần phải nhấn mạnh rằng mức độ nguy hiểm do vacxin nhỏ hơn rất nhiều so với mức độ nguy hiểm do bệnh nhiễm trùng tương ứng gây ra. Thí dụ, tỷ lệ biến chứng nguy hiểm do bệnh ho gà gấp hàng trăm đến hàng nghìn lần phản ứng nguy hiểm do vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván gây ra. Khi cân nhắc để quyết định xem một vacxin nào đó có được đưa vào sử dụng hay không, cần phải so sánh giữa mức độ phản ứng do vacxin và tính nguy hiểm của bệnh nhiễm trùng tương ứng. 1.2.4.2. Hiệu lực. Các kháng thể tạo ra không phải cái nào cũng có hiệu lực tức là tiêu diệt được yếu tố gây bệnh. Do yếu tố gây bệnh có nhiều kháng nguyên kháng khác nhau nên trong việc sản xuất vacxin trước tiên phải làm sao cho đáp ứng miễn dịch chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên “sinh tử” nghĩa là nếu đánh vào đó thì các yếu tố gây bệnh sẽ bị tiêu diệt hay ít nhất cũng không còn khả năng gây hại. Vacxin có hiệu lực lớn là vacxin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn tại trong một thời gian dài. Hiệu lực gây miễn dịch của vacxin trước hết được đánh giá trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa. Như vậy, tính hiệu lực có thể dực đánh gía trên thực nghiệm nhưng cái chính vẫn là trên thực địa qua đánh giá sau tiêm chủng và khả năng phòng các bệnh do các yếu tố gây bệnh gây ra. Trên động vật thí nghiệm:  Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể hoặc xác định mức độ dương tính của phản ứng da. Cách đánh giá này chưa cho biết hiệu lực bảo vệ, mới chỉ cho biết mức độ đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật đối với loại vacxin thử nghiệm  Cách thứ hai, xác định tỷ lệ động vật đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng vi sinh vật gây bệnh. Hình 1.8: Nghiên cứu vacxin trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm trên khỉ. Trang 9 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Trên thực địa: Dù đã được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra và đã được đánh giá trên động vật, trước khi đưa ra tiêm chủng rộng rãi, vacxin đều phải được thử nghiệm trên thực địa (field test): Vacxin được tiêm chủng cho một cộng đồng, theo dõi thống kê tất cả các phản ứng phụ và đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới. Tính hiệu lực cần được đánh giá trên bình diện cá thể (cho từng người) và trên bình diện tập thể (herd immunity: miễn dịch quần thể). Trong việc đánh giá tập thể thì hiệu lực của vacxin còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau như việc bảo quản, việc vận chuyển và cách sử dụng hay tiêm chủng vacxin. 1.2.4.3. Tính kháng nguyên hay tính kháng thể. Người ta gọi khả năng kích thích cơ thể tạo thành kháng thể là tính kháng nguyên. Tính kháng nguyên có thể mạnh hay yếu. Kháng nguyên mạnh là kháng nguyên khi đưa vào cơ thể một lần đã sinh ra nhiều kháng thể, còn kháng nguyên yếu là những chất phải đưa vào nhiều hoặc phải kèm theo một tá dược mới sinh được một ít kháng thể 1.2.4.4. Tính miễn dịch hay tính mẫn cảm. Vacxin gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một protein đặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính. 1.3 Phân loại vaccine. Vacxin có thể là các virus hoặc vi khuẩn sống, giảm độc lực, khi đưa vào cơ thể không gây bệnh hoặc gây bệnh rất nhẹ. Vacxin cũng có thể là các vi sinh vật bị bất hoạt, chết hoặc chỉ là những sản phẩm tinh chế từ vi sinh vật. Dựa vào thành phần kháng nguyên có trong vacxin người ta chia làm các loại sau: 1.3.1 Vacxin thế hệ thứ nhất. Vacxin thế hệ thứ nhất hay vacxin toàn khuẩn là loại vacxin chứa kháng nguyên lấy từ thân, vỏ bọc và độc tố của các vi sinh vật gây bệnh. Trong loại vacxin này được chia làm ba loại:  Vaccin bất hoạt là các vi sinh vật gây bệnh bị giết bằng hóa chất (thường dùng formalin) hoặc bằng nhiệt- đun nóng ở một nhiệt độ thích hợp. Thí dụ: Các vacxin chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A. Trang 10 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Hình 1.9: Vacxin bại liệt bất hoạt (IPV) (trái) và vacxin phòng bệnh dại LYSSAVAC N (phải) Ưu điểm: An toàn hơn vì các vi sinh vật không còn khả năng phục hồi dạng độc. Nhược điểm:  Tính miễn dịch kém hơn, hầu hết các vacxin loại này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn, cần phải tiêm nhắc nhiều lần.  Đắt hơn  Vacxin vi khuẩn, virus sống, giảm độc lực là vacxin chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn hoặc virus được nuôi cấy dưới những điều kiện đặc biệt nhằm làm giảm hoạt lực, giảm đặc tính độc hại của chúng. Hình 1.10: Vacxin sởi giảm độc lực MVVAC (trái) và vacxin thủy đậu giảm độc lực Varilrix (phải). Ưu điểm: Trang 11 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao do chúng nhân lên theo chu kỳ thời gian trong cơ thể. Vaccin điển hình loại này thường gây được đáp ứng miễn dịch dài hạn và là loại vaccin được ưa chuộng dành cho người lớn khỏe mạnh. Ví dụ: Các vaccin ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào và quai bị đều thuộc loại này. Nhược điểm: Các vaccin loại này có thể gây nguy hiểm vì chúng có thể không ổn định và có thể trở lại dạng độc gây bệnh. Ví dụ: Vaccin bại liệt có thể gây chứng bại liệt cho trẻ được tiêm chủng với tỉ lệ 3/106 (tại Mỹ, theo Girard,1985). Tiêm chủng vaccin đậu mùa có thể gây viêm não tỉ lệ 5/106 (tại Mỹ, theo Girard,1985).  Vacxin có nguồn gốc từ độc tố anatoxin_Vaccine dưới đơn vị: Là vaccine sản xuất chứa những kháng nguyên tương đối tinh khiết phân lập từ virus hoặc vi khuẩn gây bệnh. Hình 1.11: Vacxin uốn ván hấp phụ VAT (trái) và vacxin giải độc tố bạch hầu, uốn ván Td (phải) Ngoài vacxin chứa toàn bộ tế bào vi sinh vật, một số thành phần tiết ra của chúng cũng có khả năng kích thích miễn dịch đã được biết như các độc tố (toxoid). Vacxin loại này chứa các độc tố đã làm bất hoạt ( gọi là giải độc tố hay anatoxin). Các độc tố được chế tạo thành sau khi đã được ủ với formalin cho đến khi mất độc tính. Mức độ thuần khiết hơn toàn bô vi sinh vật cho nên các tính mẫn cảm, sinh kháng nguyên và tính đặcc hiệu đều cao hơn hai loại vacxin trên. Ví dụ như vacxin giải độc tố uốn ván hay bạch hầu. Trang 12 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Phối hợp vacxin: Mục đích chính của việc phối hợp vaccin là làm giảm bớt số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng. Có hai loại phối hợp vaccin:  Tiêm chủng vaccin phối hợp (trộn các vaccin với nhau, tiêm chủng cùng một lần, cùng một đường).  Tiêm chủng nhiều vaccin riêng biệt trong cùng một thời gian, có thể ở các vị trí khác nhau hoặc theo những đường khác nhau. Hình 1.12: Vaccin phối hợp phòng bệnh sởi-quai bị-rubella MMR II và Trimovax Phối hợp vaccxin phải đảm bảo giữ được hiệu lực tạo miễn dịch và không gây ra tác hại gì. Hiệu lực tạo miễn dịch đối với mỗi thành phần vacxin ít nhất phải bằng khi chúng được tiêm chủng riêng rẽ. Một số trường hợp khi phối hợp vacxin sẽ tạo ra được đáp ứng miễn dịch mạnh hơn. Ngược lại có những trường hợp phối hợp không hợp lý làm giảm hiệu lực tạo miễn dịch. Sự phối hợp vacxin hợp lý sẽ không làm tăng tỷ lệ phản ứng phụ. Nghĩa là độ an toàn vẫn được đảm bảo như khi chúng được tiêm chủng riêng rẽ ở những thời gian khác nhau. 1.3.2 Vacxin thế hệ thứ hai. Vacxin thế hệ thứ 2 và thế hệ thứ ba đều là vacxin tái tổ hợp sẽ thay thế hoàn toàn vacxin cổ điển (vacxin thế hệ thứ nhất) còn được gọi là subunit vaccin. Đó là loại vacxin chỉ sử dụng những antigen của vi sinh vật (subunit) thích hợp nhất để kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh nhất. Với công nghệ gen hiện đại, các antigen này được tổng hợp bằng cách cắt đoạn gen tổng hợp nên protein đặc trưng cho vi sinh vật gây bệnh, ghép gen này vào bộ gen của vi khuẩn, của nấm men khác hay tế bào nuôi cấy để tạo ra protein đặc hiệu cho mầm bệnh, dùng protein này đề tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu. Ưu điểm: Trang 13 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Kháng nguyên sẽ dùng để kích thích miễn dịch được phan lập từ phần lành tính, không gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh, và được tổng hợp bằng các tế bào vi sinh vật hay động vật đã được lắp ráp gen, đảm bảo được tính an toàn trong sản xuất  Dạng vacxin này an toàn vì ít chất lạ hơn và không chưa toàn bộ gen của vi sinh vật nguyên thủy và khhong tái sản xuất trong cơ thể nhận, ít tác dụng phụ, khả năng miễn dịch cao.  Giảm giá thành sản xuất, vì thay thế được các công đoạn đắt tiền bao gồm môi trường nuôi cấy mô động vật hoặc phôi bằng các môi trường nuôi cấy vi sinh vật thông thường, tương đối đơn giản. Ngoài ra không phải trang bị tốn kém cho vấn đề đảm bảo tính an toàn cao (ví dụ vắc-xin thông dụng chống bệnh lở mồm long móng thường có giá thành cao do sản xuất đòi hỏi nhà xưởng phải an toàn). Giá thành bảo quản và vận chuyển thấp nhờ giảm được các yêu cầu về làm lạnh và đông khô.  Tránh được việc phải thử nghiệm tính an toàn trên qui mô lớn, vì vacxin không chứa tác nhân gây bệnh Hạn chế : Kỹ thuật chiết tách kháng nguyên phức tạp và tốn kém. Ví dụ: Một điển hình của vaccin dạng này là vacxin phòng viêm gan virus B thế hệ II. Đó là vaccin tạo bằng cách lây nhiễm vius viêm gan B vào tế bào chủ cho virus sản xuất kháng nguyên. Sau đó tách chiết và gây bất hoạt virus để tạo vaccin. Hình 1.13: Cấu trúc virus viêm gan B và vacxin phòng viêm gan B thế hệ 2. 1.3.3 Vacxin thế hệ thứ ba. Là vacxin tái tổ hợp trong đó các antigen đặc hiệu được tổng hợp từ ADN của vi sinh vật được phối hợp với các tá dược làm gia tăng tính miễn dịch. Miễn dich gia tăng: là cách để làm tăng mức kháng thể vì làm kích thích tế bào ghi nhớ (stimulating the memory celles). Một số hợp chất có khả năng làm gia tăng hiệu quả của vacxin virus hoặc vacxin toxoid do làm gia tăng sự kìm chế kháng Trang 14 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường nguyên trong hệ thống bạch huyết. Các chất này được gọi là các chất hỗ trợ (Adjuvant). Các chất hỗ trợ: Đối với vacxin toxoid dùng adjuvant gồm có aluminum sunfate_ Al2(SO4)3 và aluminum hydroxid _Al(OH)3, còn đối với vacxin vius dùng dầu vô cơ và dầu phộng. Cơ chế tác dụng: một phần các chất adjuvant sẽ liên kết với kháng nguyên và sẽ làm kháng nguyên dễ bị đánh bắt bởi macrophage, đồng thời có thể làm cho các lymphocytes nhận diện các kháng nguyên đã liên kết một cách hiệu quả hơn các kháng nguyên ở dạng hoà tan. Các vấn đề đặc ra:  Cần phải nhận biết được antigen đặc hiệu cao có tác dụng kích thích sự miễn dịch.  Việc nuôi tế bào sống phải tái tạo lại được cấu trúc các antigen cần sản xuất.  Kích thước của antigen sau đó phải được tăng lên để thúc đẩy sự thực bào và đáp ứng miễn dịch. Phương pháp này dùng để tổng hợp vacxin ngừa virus viêm gan là một subunit chế từ kháng nguyên bề mặt (HbsAg), tổng hợp trong tế bào nấm men hay động vật nuôi cấy đã lắp ráp gen (Tiollais,1984, Giard, 1985); Chế phẩm đã được tinh chế, loại bỏ các protein và các đoạn ADN của chính tế bào chủ. Hình 1.14: Vacxin phòng bệnh viêm gan B r-Hbvax và vacxin Cúm INFLUVAC thế hệ III Vacxin này có ưu điểm là không chế tạo từ máu người đã nhiễm virus như trước đây nên tránh được tiếp xúc với máu nhiễm HIV.( Vius viêm gan B có vỏ ngoài lypoprotein. Kháng nguyên bề mặt là protein chính của vỏ ngoài, được phát hiện trong máu người bị nhiễm: Vào năm 1963, người ta đã phát hiện trong huyết thanh bệnh Trang 15 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường nhân ưa chảy máu một kháng thể tác dụng được với kháng nguyên (virus), đến năm 1968, nó được xác định là kháng nguyên bề mặt của huyết thanh bệnh nhân viêm gan B (gọi là HbsAg) Một vacxin khác là vacxin sởi thế hê mới được điều chế ở trung tâm nghiên cứu vi sinh học ứng dụng (Porton Down nước Anh) với sự hợp tác của trường Đại học Queen (Belfast) có chứa hai thành phần kháng nguyên, một ngưng kết tố hồng cầu và một protein liên kết, cả hai được tổng hợp bằng kỹ thuật tái tổ hợp ADN. Đó còn gọi là vacxin đa trị. Một vacxin khác là vacxin dịch tả được sản xuất từ những genes tạo toxin của vi khuẩn dịch tả đã được triển khai sản xuất từ năm 1993. 1.3.4 Dạng kháng - kháng thể vacxin. Một hướng mới trong sản xuất vacxin là dùng các kháng –kháng thể làm vacxin. Kháng – kháng thể đóng vai trò nhái lại cấu trúc của kháng thể đã được antigen từ vi sinh vật tạo thành nhưng chúng an toàn hơn. Nguyên tắc sản xuất vacxin này như sau:  Đầu tiên sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên Ab1. Kháng thể loại này gọi là diotypic.  Sau đó diotipic được tiêm vào thú để tạo kháng kháng thể Ab2 ( gọi là anti diotypic Ab2). Trong cấu trúc của kháng- kháng thể có phần trùng với kháng nguyên. Ab2 bây giờ có vai trò như một antigen xác định nhưng đơn giản hơn so với antigen nguyên thủy ban đầu và được dùng làm vacxin.  Cơ thể nhận được vacxin chứa Ab2 sẽ đáp ứng tạo kháng thể Ab3.  Nếu sau đó hệ miễn dịch tiếp xúc với antigen nguyên thuỷ, Ab3 sẽ phản ứng với antigen, phá huỷ hoặc làm mất hoạt tính của chúng. Ưu điểm:  Không phải tiêm vi sinh vật sống hoặc chết vào cơ thể.  Vacxin này chuyên biệt cao vì chống lại trực tiếp phàn antigen đặc trưng một cách chuyên biệt nhất.  Có một vài kháng nguyên không thể kích thích hệ thống miễn dịch của trẻ sơ sinh nhưng vacxin loại này chứa protein có thể cho một đáp ứng miễn dịch ở trẻ em một cách nhanh chóng  Vacxin này có thể nhận biết vị trí nhận trên tế bào. Vì vậy có thể dùng để khoá sự tấn công của virus trên tế bào. Đây cũng là một hướng để sản xuất vacxin kháng HIV. Một vấn đề quan trọng trong sản xuất kháng – kháng thể văc-xin là nguồn idiotipic antibody. Trong đó nguồn kháng thể đơn dòng từ tế bào người sẽ tốt hơn từ tế bào chuột. Trang 16 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường II. Ứng dụng của vaccine. 2.1 Nguyên lý sử dụng vaccine. 2.1.1 Liều lượng và đường đưa vaccin vào cơ thể. Liều lượng Liều lượng vaccin tùy thuộc vào loại vaccin và đường đưa vào cơ thể. Liều lượng quá thấp sẽ không đủ khả năng kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, liều lượng quá lớn sẽ dẫn đến tình trạng dung nạp đặc hiệu đối với lần tiêm chủng tiếp theo. Đường tiêm chủng có ba đường chủ yếu:  Chủng (rạch da): Đây là đường cổ điển nhất, được thực hiện ngay từ lúc Jenner sáng chế ra vaccin phòng bệnh đậu mùa. Đối với vaccin này, đường chủng vẫn được dùng cho tới khi bệnh đậu mùa bị tiêu diệt hoàn toàn trên hành tinh của chúng ta (1979), không cần phải chủng đậu nữa. Ngày nay đường chủng vẫn còn được sử dụng cho một số ít vaccin.  Đường tiêm: Có thể tiêm trong da, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp, không bao giờ tiêm vaccin vào đường tĩnh mạch. Tiêm trong da có thể được thực hiện bằng bơm kim tiêm hoặc bằng bơm nén áp lực không kim.  Đường uống: Đường uống là đường đưa vaccin vào cơ thể dễ thực hiện nhất. Tuy nhiên chỉ thực hiện được đối với vaccin không bị dịch đường tiêu hóa phá hủy. Cùng với tiến bộ trong sự hiểu biết về vai trò của miễn dịch tại chỗ do IgA tiết, những vaccin phòng bệnh đường tiêu hóa (hoặc bệnh ở nơi khác nhưng vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa) đã được sử dụng hoặc đang được nghiên cứu đưa vào cơ thể bằng cách uống. Đường uống kích thích miễn dịch tiết tại chỗ mạnh hơn nhiều so với đường tiêm. Hình 2.1: Một số hình thức đưa vacxin vào cơ thể. Trang 17 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Ngoài 3 đường nói trên, vaccin còn được vào cơ thể theo một số đường khác như khí dung, đặt dưới lưỡi, thụt vào đại tràng, những đường này ít được sử dụng. 2.1.2 Bảo quản vaccin. Vaccin rất dễ bị hỏng nếu không được bảo quản đúng. Chất lượng vaccin ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu lực tạo miễn dịch, vì vậy các vaccin cần phải được bảo quản tốt ngay từ lúc nó được sản xuất cho tới khi được tiêm chủng vào cơ thể. Thường quy trình bảo quản các vaccin không giống nhau, nhưng nói chung các vaccin đều cần được bảo quản trong điều kiện khô, tối và lạnh. Nhiệt và ánh sáng phá hủy tất cả các loại vaccin, nhất là những vaccin sống như vaccin sởi, bại liệt và vaccin BCG sống. Ngược lại, đông lạnh phá hủy nhanh các vaccin giải độc tố (như vaccin phòng uốn ván và bạch hầu). Trong quá trình sử dụng ở cộng đồng, các vaccin cần được bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng từ 2oC đến 8oC. Hình 2.2: Một số thiết bị bảo quản vacxin. Một trong những công việc quan trọng nhất trong việc tổ chức tiêm chủng là tạo lập được dây chuyền lạnh. Dây chuyền lạnh không đơn thuần là có các nhà lạnh, tủ lạnh, các phích đá hoặc các hộp cách nhiệt mà còn phải lưu ý cả những khâu trung gian trong quá trình vận chuyển vaccin và tiến hành tiêm chủng. Vaccin nếu đã bị phá hủy dù có được bảo quản lai ở điều kiện thích hợp cũng không thể có hiệu lực trở lại, cũng không có tác dụng nữa, phải loại bỏ. Một điểm cũng cần được lưu ý là các hóa chất tẩy uế, sát trùng đều có thể phá hủy vaccin. Nếu các dụng cụ tiêm chủng được khử trùng bằng hóa chất thì chỉ cần một lượng rất ít dính lại cũng có thể làm hỏng vaccin. Vì vậy các dụng cụ tiêm chủng trước khi dùng phải được rửa sạch sau đó khử trùng ở nhiệt độ cao bằng cách luộc hoặc hấp. Trang 18 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường 2.1.3 Đối tượng tiêm chủng Đối tượng cần được tiêm chủng một loại vaccin nào đó là tất cả những người có nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh mà chưa có miễn dịch. Trẻ em là đối tượng cần được đặc biệt quan tâm. Sau khi hết miễn dịch thụ động do mẹ truyền (trong thời gian khoảng 6 tháng) nguy cơ mắc bệnh của trẻ rất lớn. Mặt khác miễn dịch thụ động nhờ kháng thể truyền qua rau thai hoặc qua sữa chỉ có đối với những bệnh mà cơ chế bảo vệ chủ yếu do miễn dịch dịch thể. Đối với những bệnh mà cơ chế bảo vệ là miễn dịch qua trung gian tế bào thì trẻ có thể bị bệnh ngay từ những tháng đầu tiên sau khi sinh. Những hiểu biết này là cơ sở cho việc quy định thời điểm bắt đầu tiêm chủng cho trẻ em. Trừ những đối tượng chống chỉ định, tất cả trẻ em đều phải được tiêm chủng. Đối với người lớn, đối tượng tiêm chủng thu hẹp hơn. Thường chỉ tiến hành tiêm chủng cho những nhóm người có nguy cơ cao. Trong thời kỳ mở cửa, số lượng người đi du lịch giữa các nước ngày càng lớn, tiêm chủng cho người du lịch đã trở thành yêu cầu bắt buộc đối với cả nước có công dân đi du lịch và cả nước đón khách du lịch. Trong những năm gần đây, đề phòng bệnh uốn ván sơ sinh, phụ nữ ở lứa tuổi sinh đẻ được tiêm phòng uốn ván. Hình 2.3: Tiêm chủng vaccin Diện chống chỉ định tiêm chủng (không được tiêm chủng) có hướng dẫn riêng đối với mỗi vaccin. Nói chung không được tiêm chủng cho các đối tượng sau đây:  Những người đang bị sốt cao. Những trường hợp đang bị nhiễm khuẩn nhẹ không sốt hoặc chỉ sốt nhẹ thì không cần phải hoãn tiêm chủng.  Những người đang ở trong tình trạng dị ứng. Những người có cơ địa dị ứng hoặc có lịch sử gia đình bị dị ứng vẫn tiêm chủng được, nhưng cần phải theo dõi cẩn thận hơn. Trang 19 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Vaccin sống giảm độc lực không được tiêm chủng cho những người bị thiếu hụt miễn dịch, những người đang dùng thuốc đàn áp miễn dịch hoặc những người mắc bệnh ác tính.  Tất cả các loại vaccin virus sống giảm độc lực không được tiêm chủng cho phụ nữ đang mang thai. 2.2 Vaccine ứng dụng trong thực tế. 2.2.1 Các loại vacxin thế hệ 1 Trên thực tế các loại vacxin hiện nay chủ yếu là các loại vacxin thế hệ này. Đây là loại vacxin kinh điển đã giúp con người ngăn ngừa nhiều căn bệnh nguy hiểm mà con người có thể gặp phải trong suốt quá trình sống. Dưới đây là một số loại vacxin thế hệ này đang được sử dụng ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới:  Vacxin phòng bệnh uốn ván: Là loại vacxin giải độc tố. Có 2 loại: vacxin chỉ chứa giải độc tố uốn ván và vacxin phối hợp với vacxin phòng bạch hầu và ho gà (DPT). Giải độc tố của vi khuẩn uốn ván được hấp phụ với phosphat nhôm. Vacxin được tiêm bắp mỗi mũi 0,5ml. Tạo miễn dịch cơ bản tiêm 2 mũi cách nhau 1 tháng. Sau 6 đến 12 tháng tiêm nhắc lại. Một số lưu ý:  Đối với phụ nữ lứa tuổi mang thai, ngoài 2 mũi tạo miễn dịch cơ bản, tiêm mũi thứ 3 cách mũi thứ 2 ít nhất 6 tháng hoặc khi có thai, tiêm mũi thứ 4 cách mũi thứ 3 ít nhất 12 tháng hoặc khi có thai lần sau.  Đối với phụ nữ có thai chưa tiêm vacxin uốn ván lần nào thì tạo miễn dịch cơ bản bằng 2 mũi cách nhau 1 tháng, mũi tăng cường tiêm trước khi sinh ít nhất 1 tháng.  Vacxin phòng bệnh tả: Vacxin phòng bệnh tả đang dùng ở nước ta là vacxin bất hoạt gồm sinh typ cổ điển, sinh typ Eltor và cả biến chủng O139. Vacxin dạng huyền dịch đưa vào cơ thể theo đường uống. Đối tượng sử dụng: mọi lứa tuổi ở các vùng có dịch tả lưu hành.  Vacxin phòng bệnh thương hàn: Có 2 loại vacxin phòng bệnh thương hàn đang được sử dụng: Trang 20 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Vacxin polysaccharid của Pháp có tên là Typhim Vi. Vacxin Typhim Vi dùng cho trẻ trên 2 tuổi và người lớn, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp.  Vacxin sống giảm độc lực của Hàn Quốc có tên là Zerotyph. Vacxin Zerotyph dùng cho trẻ trên 3 tháng tuổi và người lớn, theo đường uống.  Vacxin phòng nhiễm khuẩn do H. influenzae: Đây là loại vacxin chế từ kháng nguyên vỏ của H.influenzae typ b. Vacxin của Pháp có tên Act-HiB là loại vacxin liên kết, thành phần gồm polysaccharid vỏ của H. influenzae typ b gắn với giải độc tố của vi khuẩn uốn ván. Vacxin này được dùng cho trẻ từ 5 tuổi trở xuống theo đường dưới da hoặc tiêm bắp mỗi mũi 0,5ml. Trẻ dưới 6 tháng tuổi tiêm 3 mũi cách nhau 1 tháng. Trẻ 6 đến 12 tháng tuổi tiêm 2 mũi cách nhau 1 tháng. Trẻ từ 1 đến 5 tuổi chỉ tiêm 1 mũi.  Vacxin phòng bệnh viêm màng não do cầu khuẩn màng não nhóm A và nhóm C Vacxin này được sản xuất từ polysaccharid của cầu khuẩn màng não nhóm A và nhóm C. Vacxin được sử dụng cho trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên. Tiêm dưới da hoặc tiêm bắp 1 mũi 0,5ml duy nhất.  Vacxin phòng bệnh dại: Có 2 loại vacxin phòng dại:  Vacxin chết.  Vacxin sống giảm độc lực. Vacxin hiện đang được sử dụng ở nước ta thuộc loại vacxin sống giảm độc lực, vacxin Fuenzalida và vacxin Verorab. Lưu ý: Vacxin dại chỉ tiêm cho người bị động vật nghi dại cắn. dưới đây là một số vacxin thường dùng:  Với vacxin Fuenzalida, tiêm trong da 6 mũi cách ngày, mỗi mũi 0,1ml cho trẻ tới 15 tuổi, mỗi mũi 0,2ml cho người trên 15 tuổi.  Với vacxin Verorab, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp 5 mũi, mỗi mũi 0,5ml vào các ngày 0 (ngày bắt đầu tiêm), 3, 7, 14, 30; tuỳ ý tiêm nhắc lại 1 mũi 0,5ml vào ngày thứ 90.  Vacxin phòng bệnh viêm gan virus B Vacxin phòng bệnh viêm gan virus B thế hệ 1: được sản xuất từ kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg) có trong huyết tương người lành. Vacxin phòng bệnh viêm gan virus B được tiêm cho các đối tượng có nguy cơ cao nhiễm virus viêm gan B, từ trẻ sơ sinh đến người trưởng thành. Một số lưu ý khi tiêm: Trang 21 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Đối với trẻ em, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp 3 mũi cách nhau 1 tháng, mỗi mũi 0,5ml, tiêm nhắc lại 0,5ml sau một năm.  Đối với người lớn, tiêm 3 mũi mỗi mũi 1ml: mũi thứ hai cách mũi thứ nhất 1 tháng, mũi thứ 3 cách mũi thứ hai 5 tháng; sau 5 năm tiêm nhắc lại 1 mũi 1ml.  Vacxin phòng viêm não Nhật Bản: Vacxin phòng viêm não Nhật Bản thuộc loại vacxin virus bất hoạt. Vacxin này được tiêm dưới da, mỗi mũi 0,5ml cho trẻ dưới 5 tuổi, mỗi mũi 1ml cho trẻ từ 5 tuổi trở lên. Để tạo miễn dịch cơ bản: tiêm 3 mũi. Tiêm nhắc lại mỗi năm 1 mũi ở vùng có dịch. Tiêm nhắc lại 4 năm 1 mũi ở vùng không có dịch. Trên đây là những loại vacxin cơ bản nhất của vacxin thế hệ 1, nếu kể thêm sẽ không có thời gian trình bày do ứng dụng của chúng rất nhiều. Cuối cùng, bảng 2.1 trình bày vài loại vacxin trong lịch tiêm chủ mở rộng ở Việt Nam. Bảng 2.1: Lịch tiêm chủng các vacxin trong chương trình tiêm chủng mở rộng ở Việt Nam: Vacxin BCG (phòng lao) SABIN (phòng bại liệt) DPT (phòng bạch hầu, ho gà, uốn ván). Sởi Liều lượng 0,1ml 2 giọt 0,5ml 0,5ml Đường tiêm chủng Trong da (thường ở cánh tay trái) Uống Tiêm bắp (thường ở đùi) Dưới da (thường ở cánh tay trái) Tuổi tiêm chủng Sơ sinh hoặc bất kỳ thời gian nào sau đó Sơ sinh và lúc 2, 3, 4 tháng tuổi. Trẻ < 5 tuổi hàng năm uống 2 liều tăng cường cách nhau 1 tháng. Lúc 2, 3, 4 tháng tuổi. Tiêm 1 mũi tăng cường sau khi tiêm mũi thứ ba 1 năm. Lúc 9 tháng tuổi hoặc sớm nhất sau đó. Trang 22 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường 2.2.2 Các loại vacxin thế hệ 2 và 3 Loại vacxin này đang là xu hướng của tương lai do tác dụng của nó mang lại. Hiện nay một số loại bệnh đã được chủng ngừa nhờ loại vacxin này:  Engerix-B, vaccin viêm gan siêu vi B, là một hỗn dịch vô khuẩn chứa kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus viêm gan B đã được làm tinh khiết, sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và hấp phụ trên hydroxyd nhôm. Kháng nguyên được sản xuất nhờ việc nuôi cấy tế bào nấm men theo công nghệ di truyền (Saccharomyces cerevisiae), các tế bào này mang gen qui định kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus viêm gan B (HBV).  Verorab là một loại vacxin cấy trên tế bào Vero. Ưu điểm của vacxin này là an toàn và đáp ứng miễn dịch cao sau khi được tiêm đủ liều, thời gian bảo vệ trên 1 năm nếu tiêm đúng phác đồ. Hầu hết các nước tiên tiến đã dùng vacxin này từ năm 1985. Tuy nhiên, do giá thành vacxin đắt nên số người sử dụng còn hạn chế, nhất là những nước có nền kinh tế chưa phát triển. Ngoài ra còn mộtt số vacxin loại này đang được thử nghiệm lâm sàn:  Vacxin SCI-B-Vac là loại vacxin thế hệ 3, được sản xuất thông qua nuôi cấy tế bào buồng trứng của các loài chuột đất vàng ở Trung Quốc. Thử nghiệm trên gần 500 trẻ sơ sinh tại Bệnh viện Từ Dũ TP HCM cho thấy, vacxin nói trên giúp bảo vệ trẻ khỏi nhiễm bệnh từ bà mẹ mang virus viêm gan B, ngay cả khi trẻ không dùng globulin miễn dịch.  Vacxin phòng bệnh Cúm INFLUVAC thế hệ III : là vắc xin vi rút cúm bất hoạt đa giá dựa trênkháng nguyên bề mặt được phân lập từ các chủng A và B của Myxovirus Influenza. III. Sản xuất vacxin. 3.1 Sản xuất vacxin truyền thống. 3.1.1 Quy trình sản xuất chung.  Tạo sinh khối: Đây là giai đoạn đầu tiên để sản xuất vacxin. Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để đạt được một số lượng lớn sinh khối hoặc sản phẩm của chúng (toxoid, antigen). Các chủng vi sinh vật trước khi nuôi cấy cần phải được kiểm tra về độ tinh khiết, không được lẫn vi sinh vật lạ. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong các nồi nuôi cấy đặc biệt, có các thiết bị kiẻm soát đến quá trình tăng trưởng của vi sinh vật. Trang 23 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Làm bất hoạt: Yêu cầu khi sản xuất vacxin là phải an toàn cho người sử dụng. Do đó các vi khuẩn sử dụng để chế tạo vacxin phải không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên, nghĩa là có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể.  Đối với vacxin vi khuẩn chết: có thể dùng các tác nhân diệt khuẩn như các hóa chất (formalin, alcool, aceton), tia cực tím, siêu âm…  Đối với vacxin từ vi khuẩn sống giảm độc: có thể dùng phương pháp cấy chuyền vi khuẩn nhiều lần trong môi trường nuôi cấy. Ví dụ vacxin BCG (Bacille Calmette Guerin) là vacxin được chế tạo từ vi khuẩn lao bò được cấy chuyền trong thời gian dài trên môi trường nuôi cấy.  Sản xuất ra chế phẩm: Sau khi làm bất hoạt, tiếp tục tinh khiết hóa và đông khô để tạo sản phẩm, cuối cùng đóng gói. Tuỳ theo từng loại chế phẩm có thể đóng gói dưới dạng thuốc lỏng để uống, dạng thuốc viên, dạng thuốc tiêm.  Kiểm tra sản phẩm: Cần phải kiểm tra: Độ vô trùng: chế phẩm vacxin không được lẫn các vi sinh vật lạ  Đảm bảo đủ nồng độ.  Kiểm tra khả năng gây miễn dịch Sơ đồ 3.1: Quy trình sản xuất vacxin truyền thống. 3.1.2 Vacxin được sản xuất. Do thời gian không cho phép nhóm chỉ trình bày một loại vacxin được sản xuất theo phương pháp truyền thống. Dưới đây là quy trình sản xuất vacxin viêm gan A theo phương pháp truyền thống: Trang 24 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Chọn chủng virus viêm gan A: sử dụng chủng HAV HM-175 thu được khi phân lập phân người bị nhiễm bệnh. Hình 3.1: Cấu trúc virus viêm gan A Tiến hành cấy truyền qua các loài động vật khác nhau để thu được chủng virus sản xuất được vacxin. Quá trình cấy truyền được tiến hành như sơ đồ sau: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ cấy truyền virus HAV- HM- 175 qua tế bào của các loài khác nhau. Trang 25 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Tạo sinh khối:  Nhận tế bào thận khỉ Maccaca Mulatta tiên phát một lớp (PMMK) từ Trung tâm sản xuất vacxin Sabbin (POLIOVAC).  Hỗn hợp tế bào thận khỉ có nồng độ 3.10 5 tế bào/ml trong môi trường LHE (Lactalbumin Hydrolysate Eagle) được phân chia vào các chai nhựa ba lớp ủ ở 37oC thay đổi môi trường sau khoảng 1 tuần.  Sau 1-2 ngày chọn các chai tế bào có một lớp đạt yêu cầu để gây nhiễm với virus. Gây nhiễm tế bào với 20ml hỗn hợp chủng virus sản xuất (WSV) với tỷ lệ gây nhiễm là 0.05 PFU/tế bào.  Cho virut hấp thụ vào tế bào trong 2 giờ ở 37 oC, hút bỏ hỗn hợp dịch virus còn thừa. Phân chia vào mỗi chai 200ml môi trường duy trì D’MEM 2% FBS (gồm D’MEM (Gibco) 500ml L, Glutamin (Gibco) 5mM , Gentamyxin sulfat (Gibco) 5 μg/ml, Fungizon (Gibco) 5 μg/ml, FBS (Gibco) 10ml).  Nuôi tế bào trong 21 ngày thay môi trường mỗi tuần. Nước nổi thu được trong quá trình thay môi trường được giữ lại bảo quản ở -20oC. Tinh khiết tế bào:  Ngày 22 các chai nuôi cấy được đưa vào cất giữ ở nhiệt độ -70 oC, trừ chứng tế bào (10% ở mỗi mẻ gây nhiễm được giữ lại để quan sát hiện tượng gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu và để kiểm tra các tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào). Trang 26 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Nước nổi tế bào trứng được trộn lại và sau khi ly tâm loại xác tế bào được tiến hành kiểm tra các tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu trên các dòng tế bào khác nhau (thận khỉ tiên phát, Vero, Hep2,…).  Các chai tế bào đã gây nhiễm được tiến hành làm đông tan 3 lần, sau đó trộn với nước nổi thu được trong quá trình thay môi trường để ly tâm 6000v/phút trong 1 giờ và nước nổi được siêu lọc và cô đặc bằng màng Millipore Pellicon 10.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit) đến thể tích cần thiết.  Thêm vào cặn tế bào Triton X- 100 để có nồng độ cối cùng là 2%, cho tiếp xúc với nhiệt độ môi trường khoảng 4oC trong một giời sau đó tiến hành siêu ly tâm trong 3 phút, lặp lại chu kì 0.3. Ly tâm loại bỏ cặn. nước cặn trọn với dung dịch cô đặc ở trên. Virus được siêu lọc và gây bất hoạt bằng Formalin 1/2000 ở 37 oC trong 96 giờ. Lấy mẫu kiểm tra sau khi gây bất hoạt. Pha vacxin: vacxin được pha loãng đến hàm lượng 200 μg/ml trong các dung dịch M199, Al(OH)3 và chất bảo quản như 2- phenoxyethanol và Tween 20. Kiểm tra độ an toàn, các thông số hóa lí, hóa sinh của sản phẩm. Lọc vô trùng, đóng chai, dán nhãn và đóng gói. Hình 3.2: Vacxin viêm gan A 3.2 Sản xuất vacxin thế hệ mới – Vacxin ADN tái tổ hợp. 3.2.1 Quy trình sản xuất chung. Lựa chọn các kháng nguyên đích: Lựa chọn kháng nguyên phục vụ cho quá trình sản xuất vacxin. Phân tích và xác định gen đích. Việc này được tiến hành theo sơ đồ sau: Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích và xác định gen đích. Trang 27 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Nhân giống gen: sau khi thu được gen đích, tiến hành nhân giống gen nhằm tạo ra nhiều bản sao ADN tái tổ hợp, có hai cách nhân giống gen thường được sử dụng: Dùng phương pháp PCR tạo đoạn mồi kéo dài các kháng nguyên đích. Sơ đồ 3.4: Các chu kì của kỉ thuật PCR. Trang 28 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Dùng phương pháp nuôi cấy trên tế bào vi sinh vật: thường dùng vi khuẩn E. Coli làm tế bào chủ do tốc độ sản sinh nhanh, thao tác đơn giản, tạo dòng ADN tái tổ hợp nhanh. Qui trình được thực hiện như sau: Sơ đồ 3.5: Quy trình nuôi cấy tế bào đích trên vi khuẩn E. Coli Trang 29 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ. Nuôi cây và thu nhận các protein kháng nguyên. Tinh sạch kháng nguyên: Tiến hành cô đặc kháng nguyên bằng phương pháp vi lọc tủa sau đó tinh sạch bằng các phương pháp thường dùng như sắc kí trao đổi ion, lọc gel hay sắc kí tương tác kị nước hay sắc kí ái lực để thu nhận các kháng nguyên tinh khiết. Sản xuất chế phẩm: Tuy theo chế phẩm sử dụng cũng như đặc tính của kháng nguyên mà chế phẩm được sản xuất dưới dạng thuốc uống, tiêm,… Kiểm tra sản phẩm: Kiểm tra độ an toàn của vacxin, tiến hành thử nghiệm các thông số hóa lí của chế phẩm sau đó tiến hành thử nghiệm lâm sàn trên động vật và con người. 3.2.2 Vacxin được sản xuất. Dưới đây trình bày sơ nét quy trình sản xuất vacxin viêm gan B bằng phương pháp tái tổ hợp gen: Chọn chủng sản xuất có khả năng mã hóa sinh tổng hợp kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg). Trang 30 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Hình 3.3: Hình dưới kính hiển vi và cấu trúc của virus viêm gan B. Chủng được cấy chuyển một lần trên môi trường thạch YPD/Zeocin (thành phần bao gồm Yeast extract 0.5g, Casaminoacid 1g, Dextrose 1g, Agar 1g, Zeocin (100 µg/ ml) 50 µl, nước cất 50 ml) rồi nhân lên trong môi trường YPD (thành phần gồm Yeast extract 1g, Casaminoacid 2g, Dextrose 2g, nước cất 100ml). Lắc ủ ở nhiệt độ 30 oC để trong vòng 7-8 giờ, bổ sung glyxerol với tỉ lệ 1:1 bảo quản ở -90 oC để thu được chủng sản xuất. Từ chủng sản xuất, lấy một loop ở đầu que cấy, ria trên đĩa thạch môi trường YPD/Zeocin ủ ở 30oC trong vòng 72 giờ. Tiến hành nhân chủng:  Chọn khuẩn lạc từ đĩa thạch cho vào 50ml môi trường YPD trong 2 bình tam giác. Lắc với tốc độ 200v/p, ở 30oC trong vòng 40 giờ. Đo OD600nm để kiểm tra độ đậm của chủng và kiểm tra độ thuần khiết bằng nhuộm soi kính trên kính hiển vi.  Ly tâm 4500v/p trong 10 phút, bỏ nước nổi lấy cặn. Cặn được hòa đều trong 30 ml môi trường BMGY (thành phần gồm Yeast extract 15g, Casaminoacid 30g, Yeast nitrogen base (YNB) 20.1 g, đệm Potassium phosphate 1M 150 ml, Glycerol 30 ml. nước cất 1500 ml) rồi cấy chuyển vào nồi lên men 2000 ml + 1500 ml môi trường BMGY. Khuấy với tốc độ 300v/p ở 30 oC trong vòng 48 giờ. Kiểm tra quá trình nhân lên bằng cách đo OD600nm sau 24 giờ và sau mỗi 2 giờ trong 48 giờ sau đó. Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách nhuộm soi kính trên kính hiển vi.  Cấy chuyển từ nồi lên men 2000ml sang trong nồi nuôi cấy 10000 ml + 6000ml môi trường BMGY để tiếp tục nhân lên (thành phần môi trường tương tự nhưng khối lượng và thể tích các thành phần đều tăng gấp 4 lần). Khuấy với tốc độ 300v/ Trang 31 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường p, ủ ở 30oC trong vòng 30 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết và đo OD 600nm để theo dõi quá trình nhân lên. Chỉnh pH = 6.5 bằng NH4OH sau 7 giờ nuôi cấy. Hình 3.4: Một số hệ thống lên men vi sinh vật. Sử dụng nguồn methanol là nguồn Cacbon để gây biến nạp nội bào. Thêm 80 ml môi trường BMMY 10x (thành phần gồm Yeast extract 32 g Casaminoacid 64 g Yeast nitrogen base (YNB) 42,88 g đệm Potassium phosphate 1M 320 ml) + B x500 ( gồm Na2B4O7 (Borax) 10.061 g Sodium deoxycholate 12,5 g nước cất 5000 ml) cứ sau 6 giờ bổ sung 80ml methanol 50% và sau 24 giờ bổ sung 80 ml môi trường BMMY 10x và 16 ml B x500. Luôn giữ ph ở 6.5-7 bằng NH 4OH và DO = 30% bằng hệ thống bơm. Khuấy liên tục với tốc độ 300v/p ở 30oC trong 72 giờ. Đo OD600nm để theo dõi quá trình nhân lên và biến nạp sau mỗi 6 giờ. Thu nhận tế bào, ly tâm 4500v/p trong vòng 10 phút ở 4 oC bỏ phần dịch nổi lấy phần cặn rửa 4 lần bằng dung dịch đệm ly giải (Na 2HPO4.2H2O 27,82 g , NaH2PO4 10,446 g, EDTA 37,21 g, 15 ml Tween 20, nước cất 1000 ml). Cân phần cặn vả bảo quản ở -70oC. Tách chiết HbsAg :  Phá vỡ tế bào nấm men nuôi cấy bằng bi thủy tinh và đệm ly giải. Sử dụng máy phá vỡ để làm vỡ tế bào và dùng CO2 để giữ lạnh (tốc độ phá vỡ 10000v/p ở 4oC trong 10 phút).  Rửa bi thủy tinh và tách HBsAg ra khỏi màng tế bào bằng dd đệm ly giải. Rửa cặn và ly tâm nhiều lần (4500v/p, ở 4oC trong 30 phút). Lấy nước nổi, bỏ cặn kiểm tra bằng phương pháp ELISA đế khi không còn HbsAg.  Cô đặc nước nổi bằng phương pháp siêu lọc Milipore Minitan với màng lọc Pellicon cassette M.W.100 000. Trang 32 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường  Tách hạt HbsAg bằng phương pháp siêu âm với chu kì 0.3vòng/s, với công suất 200 trong 5 phút. Tinh chế HbsAg:  Hấp thụ bằng gel aerosil 380 và mẫu với tỷ lệ 40g/1000ml. Ủ, lắc nhẹ 120v/p 37oC trong 4 giờ sau đó dem ly tâm 15 phút 4500v/p ở 20 oC, bỏ phần dịch giữ lại gel, rửa gel bằng nước muối sinh lí đến khi giá trị OD280nm ≤0.4.  Dùng đệm Borax 0,01M để phản hấp phụ HbsAg ra khỏi gel aerosil thực hiện trong 4 lần, mỗi lần ở 56oC trong 3 giờ lắc nhẹ 120v/p. Ly tâm 4500v/p sau mỗi lần phản hấp phụ.  Tách hạt HbsAg bằng phương pháp siêu âm với chu kì 0.3vòng/s, với công suất 200 trong 5 phút.  Tinh chế HbsAg bằng 4 lần siêu ly tâm phân vùng với 2 lần trong dung dịch KBr gradient (1,3 và 1,32 g/cm3) với tốc độ 25 000 v/p trong 24 giờ ở 20 o C, 1 lần trong dung dịch CsCl (1,3 và 1,32 g/cm 3) với vận tốc 25 000 v/p trong 19 giờ ở 10o C và cuối cùng là trong dung dịch gradient sucrose (10-20-30-40%) với vận tốc 25 000 v/p trong 19 giờ ở 10 o C. Các phân đoạn được kiểm tra HbsAg bằng phản ứng ELISA với qui trình ủ 30’-30’-15’. Bất hoạt virus bằng Formaldehyt 1/2000 ở 37oC trong 96 giờ. Sản xuất chế phẩm:  Cô đặc và thẩm tích chế phẩm bằng Amicon cassette.  Kiểm tra độ tinh khiết của kháng nguyên bằng phương pháp điện di trên gel Polyacrylamid, PCR hay hình ảnh thông qua kính hiển vi điện tử.  Định lượng HbsAg bằng phương pháp đo mật độ quang và ELISA.  Định lượng protein bằng phương pháp Lowry.  HbsAg tinh khiết được pha loãng trong dung dịch đệm (chứa NaCl và CH3COONa) lọc vô trùng qua màng lọc 0.22 μm, thêm chất phụ gia Al(OH)3 cho đến nồng độ đạt 300 μg/ml và hàm lượng HbsAg cuối cùng đạt 20 μg/ml . Bổ sung Merthiolat -chất bảo quản với hàm lượng 0.005%. Trang 33 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường Hình 3.5: Vacxin viêm gan B Đóng lọ, dán nhãn và đóng gói. 3.3 Vaccine đang nghiên cứu. Các vacxin này còn được xem là vắc-xin của tương lai, có 6 hướng phát triển chính hiện nay:  Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong muốn. Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vacxin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào.  Vacxin khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại.  Vacxin polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với các phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptide mô phỏng 1 quyết định kháng nguyên (epitope).  Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệu đối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên. Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X.  Vacxin ADN: ADN của tác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào người được chủng ngừa. Lợi thế của ADN là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp cho những chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngoài ra, vacxin ADN còn giúp định hướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC loại II, dẫn đến đáp ứng CD4 (đáp ứng miễn dịch dịch thể). Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình diện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 được kích thích. Tuy Trang 34 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tế bào mang ADN lạ có nguy cơ bị nhận diện là "không ta", sinh ra bệnh tự miễn. Hình 3.6: Quy trình sản xuất một vacxin ADN.  Sử dụng vectơ tái tổ hợp – dùng các vi khuẩn thuần tính hoặc các tế bào trình diện kháng nguyên như tế bào tua được chuyển gen để biểu hiện kháng nguyên mong muốn. IV. Hạn chế của vacxin. 4.1 Kém hiệu quả. 4.1.1 Kém hiệu quả về lượng. Các "lỗ hổng" trong kho tàng miễn dịch: trên lý thuyết, các tế bào lympho B có thể tạo ra hơn 1012 loại kháng thể đặc hiệu, còn lympho T có thể nhận diện trên 1015 kháng nguyên khác nhau, những con số này tuy rất lớn nhưng không phải là vô hạn, hệ miễn dịch không thể chống lại mọi thứ. Hiệu quả của vacxinxin còn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch có thể tồn tại suốt đời nhưng sự sản xuất kháng thể thì không nếu không được tái kích thích. Đột biến của tác nhân gây bệnh: đây là cơ chế sinh tồn của các tác nhân gây bệnh. Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào một cuộc rượt đuổi trường kỳ. Tiêu biểu cho cơ Trang 35 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường chế này là HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy cơ đại dịch cúm gia cầm hiện nay. 4.1.2 Kém hiệu quả về chất. Vai trò của phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn của vacxin, người ta thường tinh lọc các chế phẩm, nhưng có những vacxin quá tinh khiết lại trở nên kém hiệu quả. Đó là do hệ miễn dịch muốn được kích hoạt, phải nhận được một tín hiệu báo nguy, tín hiệu này thường không phải là kháng nguyên dùng làm vacxin. Để khắc phục, người ta dùng một số loại phụ gia trong chế phẩm vacxin. Thí dụ phụ gia Freund, nhôm hyđrôxít, nhôm phosphate hoặc trộn lẫn các vacxin với nhau. Loại phản ứng miễn dịch và hiện tượng chuyển hướng miễn dịch: đối với các tác nhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể là thích hợp (loại đáp ứng này được sự hỗ trợ của các tế bào lympho Th1). Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần sự hỗ trợ của lympho Th2) lại hữu hiệu cho các tác nhân gây bệnh nội bào. Do đó, nếu vắc-xin gây được đáp ứng miễn dịch nhưng không đúng loại đáp ứng nên có, hiệu quả cũng không được bảo đảm. Th1 và Th2 có xu hướng khắc chế lẫn nhau. Vắc-xin kinh điển có xu hướng tạo đáp ứng Th1. Do đó đối với những bệnh do tác nhân nội bào như nhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt hơn vacxin, vì vacxin lại gây hiệu quả ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ. 4.2 Tai biến. 4.2.1 Nhiễm bệnh. Vacxin sống, giảm độc lực có thể gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch. Nguy cơ hồi phục của tác nhân vi sinh: một tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lại được độc tính của mình. Nguy cơ này ở vacxin ngừa bại liệt là 10 -7, nghĩa là cứ 10 triệu trẻ em uống vacxin Sabin thì có 1 em bị tai nạn loại này. Điều không may này không ngăn cản được việc sử dụng vacxin này bởi lẽ tỷ lệ đó được xem là chấp nhận được. Nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh khác vào trong chế phẩm vacxin. Điều này có thể hạn chế bằng các quy trình sản xuất, bảo quản và sử dụng chặt chẽ. 4.2.2 Các bệnh miễn dịch. Thử nghiệm vacxin phòng bệnh dại trên cừu cho thấy có xác suất gây EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis), một bệnh tự miễn trên hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý do có thể là vắc-xin chiết xuất từ não chó đã mang theo cả những mẩu protein của tế bào thần kinh, khi tạo miễn dịch, cơ thể (được tiêm)đã tạo ra cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh của mình. Vacxin ngừa ho gà có thể gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10 -4-10-6. Việc tinh lọc vacxin này làm tăng mức an toàn nhưng một lần nữa, giảm hiệu quả. Trang 36 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường V. Kết luận. Một số vacxin rất có hiệu quả, không kể vacxin đậu mùa nổi tiếng, thí dụ vacxin ngừa bệnh uốn ván, sởi v.v. Một số vacxin khác có hiệu quả vừa phải (hiệu quả của BCG chỉ vào khoảng 50%). Ngược lại, có những bệnh đến đầu thế kỷ 21 vẫn chưa có vacxin thích hợp (AIDS, sốt rét v.v.). Do vậy, vacxin chưa phải là vũ khí vạn năng để đối phó với bệnh tật. Hiệu quả của vacxin cũng khó đánh giá chính xác. Kết quả nghiên cứu trên động vật không thể áp dụng 100% cho loài người, vì những đặc điểm riêng của từng loài. Trên lý thuyết, phương pháp duy nhất để chứng minh hiệu quả là lấy 2 nhóm người, một nhóm được tiêm chủng, một nhóm không rồi truyền mầm bệnh cho cả hai nhóm để xem kết quả. Dĩ nhiên phương pháp này không thể sử dụng được vì trái đạo đức. Do đó, người ta biến hóa đi một chút, cũng chia ra 2 nhóm được chủng và không được chủng như trên nhưng không truyền bệnh mà chỉ quan sát sự nhiễm bệnh qua các ngã thông thường. Hạn chế của phương pháp này là nếu một vacxin tỏ ra có hiệu quả, người ta không thể triển khai nghiên cứu trên quy mô rộng để tính chính xác hiệu quả vì như thế một số lớn quần chúng sẽ bị thiệt thòi do không được bảo vệ. Bởi vậy, khi một vacxin được xem là có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng cho mọi người và quan sát sự giảm số người mắc bệnh. Tuy nhiên, ngay cả khi một bệnh có chiều hướng giảm xuống, người ta cũng không biết vai trò thật sự của vắc-xin, thí dụ tần suất bệnh lao đã giảm rất nhiều, nhưng vai trò của các biện pháp vệ sinh, cách ly nguồn lây cũng rất đáng kể. Tính kém hiệu quả của vacxin có thể biểu hiện về mặt chất (đáp ứng miễn dịch không thích hợp) hoặc về mặt lượng (không có đáp ứng miễn dịch). Trang 37 Vacxin và Ứng Dụng Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi Trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] GS. Nguyễn Ngọc Lanh, GS.TS Văn Đình Hoa (chủ biên) Miễn dịch học NXB Y Học Hà Nội(2006). [2] GS.TS Phạm Văn Ty (chủ biên) Công Nghệ Sinh Học (tập 5) NXB Giáo Dục [3] GS. Nguyễn Lân Dũng (chủ biên) Vi Sinh Vật Học NXB Giáo Dục [4]http://vietsciences.free.fr/giaokhoa/biology/nguyenlandung/visinhvathoc/chuong22sanxuatvasudungvaccin.htm [5]https://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:StjhUJB2FIwJ:https:// www.lhu.edu.vn/Data/News/388/files/ CN_sinh_hoc_duoc_pham_tiep_theo_9npem.doc+&cd=1&hl=en&ct=clnk [6]http://elib.tic.edu.vn:8080/dspace/bitstream/123456789/7063/1/5971.pdf [7]http://www.slideshare.net/ngocgiaunguyen94617/95395941cacphuongphapsanxuatvacxincnvsvoivacxinthehemoi-1 Trang 38 Vacxin và Ứng Dụng