Nội dung

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  Môn: Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề Tài: Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches (Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống: Các Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi Bậc) GVGD: Phan Thị Kim Liên TP.HCM,THÁNG 11-2014 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 2 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm MỤC LỤC TÓM TẮT.................................................................................................................................. 4 1. Giới thiệu............................................................................................................................ 5 1.1. Coliforms là gì?................................................................................................................... 7 2. Mục tiêu............................................................................................................................ 10 3. Phương pháp cổ điển.........................................................................................................10 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống...............................................................................................10 3.2. Kỹ thuật lọc màng.............................................................................................................12 4. Phương pháp enzyme........................................................................................................15 4.1 Nguyên tắc chung............................................................................................................... 15 4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme.................................................................................17 4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn.................................................19 4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry................................................20 4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn.....................21 4.6. Kết luận về phương pháp enzyme.....................................................................................22 5. Phương pháp phân tử........................................................................................................23 5.1. Phương pháp miễn dịch.....................................................................................................23 5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic....................................................................................27 6. Kết luận............................................................................................................................. 42 LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................... 45 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 3 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm TÓM TẮT Nhóm coliform được sử dụng rộng rãi như một chỉ tiêu của chất lượng nước và về phương diện lịch sử đã dẫn đến khái niệm bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục đích của việc xem xét này là để kiểm tra phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc có thể được đề xuất cho việc kiểm tra định lượng coliforms trong nước uống. Trên thực tế, nhu cầu về các thử nghiệm nhanh hơn, nhạy hơn và cụ thể hơn là điều cần thiết trong ngành công nghiệp nước. Các kỹ thuật thông thường và được thừa nhận rộng rãi, đã được thảo luận, như là các phương pháp nổi bậc từ sự phát triển của các nghiên cứu gần đây. Phương pháp truyền thống đã được chấp nhận để phát hiện coliform bao gồm kỹ thuật lên men nhiều ống (MTF) và kỹ thuật màng lọc (MF) sử dụng môi trường nuôi cấy cụ thể và điều kiện ủ khác nhau. Những phương pháp này vẫn còn những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ bệnh, sự can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể và việc phát hiện kém đối với các vi sinh vật phát triển chậm hoặc có thể phát triển và tồn tại mà không nuôi cấy. Ngày nay, kỹ thuật màng lọc đơn giản và không tốn kém là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho việc định lượng thông thường coliforms trong nước uống. Việc phát hiện coliforms dựa trên hoạt tính enzyme đặc trưng đã cải thiện được độ nhạy của các phương pháp này. Các enzyme β-D galactosidase và β-D glucuronidase được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng coliforms tổng và Escherichia coli, tương ứng. Nhiều chất chromogenic và fluorogenic được dùng để phát hiện cụ thể hoạt tính của các enzyme này và các thử nghiệm mang tính thương mại khác nhau được dựa trên các chất có sẵn này. Nhiều sự so sánh đã cho thấy những thử nghiệm này có thể là một thay thế thích hợp cho các kỹ thuật cổ điển. Tuy nhiên, phương pháp này thì đắt hơn, và thời gian ủ, mặc dù giảm, nhưng vẫn còn quá dài để cho kết quả cùng ngày. Các công cụ phân tích tinh vi hơn như kỹ thuật đếm tế bào pha rắn có thể được tận dụng để làm giảm thời gian cần thiết để phát hiện các hoạt động của GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 4 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm enzyme ở vi khuẩn, với một ngưỡng phát hiện thấp. Phát hiện coliforms bằng phương pháp phân tử này cũng được đề cập, vì các phương pháp này cho những phát hiện rất cụ thể và nhanh chóng mà không cần nuôi cấy. Ba phương pháp phân tử được đánh giá ở đây: các kỹ thuật miễn dịch, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai tại chỗ (ISH). Trong cách phương pháp miễn dịch, các kháng thể khác nhau chống lại vi khuẩn coliform được tạo ra, nhưng việc áp dụng kỹ thuật này thường cho thấy kháng thể mang tính đặc hiệu thấp. PCR có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn coliform bằng phương pháp khuếch đại tín hiệu: trình tự DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b-galactosidase) và gen uidA (b – D gen glucuronidase) đã được sử dụng để phát hiện tổng coliforms và E. coli, tương ứng. Tuy nhiên, việc định lượng với PCR vẫn thiếu chính xác và đòi hỏi phải làm việc trong phòng thí nghiệm chuyên dụng. Kỹ thuật FISH liên quan đến việc sử dụng các đầu dò oligonucleotide để phát hiện các trình tự bổ sung bên trong tế bào cụ thể. Đầu dò oligonucleotide được thiết kế đặc biệt cho phạm vi của các phân tử RNA 16S của Enterobacteriaceae có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng vi sinh của các mẫu nước uống. FISH nên là một kỹ thuật cần quan tâm có thể thay thế cho các phương pháp nuôi cấy thông thường để xác định nhóm coliform trong nước uống, vì nó cung cấp các dữ liệu định lượng trong một khoảng thời gian khá ngắn (6 – 8 tiếng), nhưng vẫn đòi hỏi nỗ lực nghiên cứu. 1. Giới Thiệu Việc bảo vệ sức khỏe công đồng và môi trường đòi hỏi nước uống phải an toàn, điều đó có nghĩa là không chứa VSV gây bệnh. Giữa các VSV phân tán trong các nguồn nước, VSV gây bệnh ở ruột là những loại dễ bắt gặp nhất. Như một hệ quả, các nguồn ô nhiễm phân trong nước dành cho hoạt động con người phải được kiểm soát chặt chẽ. Tác nhân gây bệnh đường ruột, như Escherischia coli O157: H7, thường hiện diện tại nồng độ rất thấp trong môi trường nước trong một hệ vi thực vật đa dạng. Các phương pháp phức tạp được đòi hỏi để phát hiện ra chúng, và những phương pháp này thì vô cùng tốn thời gian. Hầu hết coliform hiện diện với số lượng lớn trong hệ thực vật đường ruột của người và động vật máu nóng khác, và vì GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 5 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm thế nên chúng được tìm thấy trong phân thải. Như một hệ quả, coliforms, được phát hiện ở nồng độ cao hơn vi khuẩn gây bệnh, được sử dụng như một chỉ số thể hiện sự hiện diện tiềm ẩn của tác nhân gây bệnh đường ruột trong môi trường nước. Việc sử dụng các nhóm coliform, và cụ thể hơn là E. coli, như một chỉ số vi sinh của chất lượng nước có từ sự phân lập đầu tiên của các vi sinh vật này từ phân vào cuối thế kỷ thứ 19. Coliforms cũng thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên đa dạng, như một vài loài trong số đó có nguồn gốc từ đất, nhưng nước uống không phải là một môi trường tự nhiên của chúng. Sự hiện diện của chúng trong nước uống ít nhất phải được coi là một mối đe dọa hoặc dấu hiệu của vi sinh vật về sự suy thoái của chất lượng nước. Số mẫu coliform tổng dương tính trong một nguồn nước đã được xử lý mà thường không có coliform thì có thể là chỉ ra việc xử lý không có hiệu quả, mất mát của chất khử trùng, bị chọc thủng (McFeters và các cộng sự, 1986), sự xâm nhập của nước ô nhiễm vào các nguồn cung cấp nước sinh hoạt (Geldreich và các cộng sự, 1992; Clark và các cộng sự, 1996) hoặc các vấn đề tái sử dụng (LeChevallier, 1990) trong hệ thống phân phối, và, như một hệ quả, không được cho phép. Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số về việc có thể hiện diện các tác nhân gây bệnh đường ruột trong các hệ thống thủy sinh là một đề tài tranh luận trong nhiều năm. Nhiều tác giả đã báo cáo dịch bệnh qua đường nước trong cuộc họp quy định coliform trong nước (Payment và các cộng sự, năm 1991; Moore và các cộng sự, 1994; MacKenzie và các cộng sự, 1994; Gofti và các cộng sự, 1999). Tuy nhiên, mục đích của bài viết này không phải là để thảo luận về các khái niệm chỉ số, mà là để xác định phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc có thể được đề nghị cho việc theo dõi coliforms trong nước uống. Sự cần thiết của các kiểm nghiệm nhanh và nhạy hơn là không thay đổi trong ngành công nghiệp nước, với mục đích là theo dõi trực tuyến liên tục của các nhà máy xử lý nước thải. 1.1. Coliforms là gì? Các nhóm coliform bao gồm một sự đa dạng phong phú về thuật ngữ chi và loài, dù có hoặc không thuộc họ Enterobacteriaceae. Hầu hết các định nghĩa GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 6 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm coliforms là chủ yếu dựa trên các đặc tính sinh hóa thông thường. Trong các phương pháp tiêu chuẩn cho việc kiểm tra nước và nước thải (Part 9221 và 9222; APHA và các cộng sự, 1998),các thành viên nhóm coliform được mô tả như sau: 1. Tất cả đều kỵ khí và hiếu khí tuỳ ý, gram -, không bào tử, vi khuẩn hình que và lên men lactose sinh khí và tạo axit trong vòng 48h ở 35 oC (Kỹ thuật lên men nhiều ống; Phần 3.1) hoặc 2. Tất cả hiếu khí và kỵ khí nhiều tuỳ ý, gram âm, không bào tử, vi khuẩn hình que phát triển thành một khuẩn lạc màu đỏ ánh kim trong vòng 24h ở 35 oC trên một môi trường loại Endo có chứa lactose (màng lọc kỹ thuật; Phần 3.2). Định nghĩa các thành viên của nhóm coliform gần đây đã được mở rộng bao gồm các đặc điểm khác, chẳng hạn như phản ứng β-D-galactosidase dương tính (Part 9223;. APHA et al, 1998) (kiểm tra enzyme nền, phần 4.2). Việc tìm kiếm các vi sinh vật β-galactosidase dương tính và đệm β-galactoside-dương tính cũng cho phép một bước xác nhận lên men lactose, khi đó kỹ thuật lên men nhiều ống được sử dụng. Các thử nghiệm cytochrome oxidase cũng được sử dụng như là một thử nghiệm khẳng định để loại bỏ một số vi khuẩn của chi Aeromonas hoặc Pseudomonas mà có thể lên men lactose. Định nghĩa của vi khuẩn coliform hơi khác tùy thuộc vào quốc gia hoặc các tổ chức chịu trách nhiệm về các quy định giám sát vi sinh. Tại Canada, định nghĩa giống như ở Mỹ, và khác với một số nước châu Âu. Ví dụ, Hiệp hội Tiêu chuẩn Pháp (NFT90-413 và NFT90-414; AFNOR, 1990), nó có thể được xem là một mô hình đại diện cho luật pháp châu Âu, xác định coliforms tổng (TC) như:  Hình que, không bào tử, gram âm, oxidase âm tính, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý. Vi khuẩn có thể phát triển trong sự hiện diện của muối mật hoặc chất có hoạt tính bề mặt thay thế khác có tác dụng ức chế sự tăng trưởng tương tự và lên men lactose sinh khí và sinh acid (hoặc aldehyde) trong vòng 48 giờ ở 37 ± 1oC. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 7 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm AFNOR (1990) đi xa hơn bằng cách định nghĩa nhóm coliform khác, bao gồm cả các coliform chịu nhiệt (còn gọi là coliforms phân, FC), và cụ thể hơn, E. coli là:  Coliforms chịu nhiệt có cùng đặc tính lên men như coliforms (TC), nhưng nhiệt độ 44 ± 0,5oC.  E. coli là một coliform chịu nhiệt, chỉ khác một vài điều, tạo indole từ tryptophane tại nhiệt độ 44 ± 0.5oC, cho kết quả thử nghiệm methyl đỏ dương tính, không thể tạo ra acetyl-methyl carbinol và không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất của nó. Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số ô nhiễm phân phải phụ thuộc vào các quy định nghiêm ngặt của chính phủ (Bảng 1). E. coli là coliforms phổ biến nhất trong hệ thực vật đường ruột của động vật máu nóng động vật và sự hiện diện của nó có thể liên quan chủ yếu đến ô nhiễm phân. Do đó không được phép có E. coli trong nước uống. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) đã phê duyệt một số phương pháp để phát hiện coliform: các kỹ thuật lên men nhiều ống, kỹ thuật màng lọc và các thử nghiệm có mặt /không có mặt (bao gồm các thử nghiệm ONPG – MUG). AFNOR (1990) đã phê duyệt kỹ thuật lên men nhiều ống và kỹ thuật màng lọc. Các phương pháp này có những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ, sự can thiệp của sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể ở các nhóm coliform và độ phát hiện kém của đối với coliforms phát triển chậm hoặc bị tổn thương. Vì thế, tùy thuộc vào hệ thống môi trường, chỉ một phần nhỏ (0,1-15%) trong tổng số quần thể vi khuẩn có thể được đếm bởi phương pháp nuôi cấy (Amann và các cộng sự, 1990). Tỷ lệ vi khuẩn không nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện không thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong suốt quá trình nuôi cấy hoặc bởi khả năng sống sót hoặc hoạt động của chúng ở trạng thái không nuôi cấy (VBNC hoặc ABNC) (Roszak và Colwell, 1987; Joux và Lebaron, 2000; Colwell và Grimes, 2000). GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 8 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Bảng 1. Một số quy định chống nhiễm khuẩn hiện và hướng dẫn cho nước uống Coliform tổng Yêu cầu giám sát E.coli Mật độ Mẫu/tháng 0/100 ml (95%) United một mẫu liên tiếp từ 0/100 cùng vị trí không được (100%) Statesa ml ≈ 1/1000 sinh vật có coliform 0/100 ml (90%) không nên chứa nhiều Canada b hơn 10 CFU/100 ml 0/100 ml <5000 một mẫu liên tiếp từ (100%) 5000 – 9000 4 mẫu/ tháng 1/1000 sinh vật cùng một vị trí không được có coliform Tổ chức y tế thế giớic 0/100 ml (95%) 0/100 ml (100%) >9000 90 + (1/10000 sinh vật) a. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ năm 1990. b Bộ y tế Canada, 1996. c Tổ chức Y tế Thế giới, 1994. 2. Mục Tiêu Vì nước uống là chế độ nghèo dinh dưỡng, các phương pháp nuôi cấy kém nhạy trong việc phát hiện các tế bào vi khuẩn bị tổn thương và sắp chết có thể tạo ra những hạn chế nghiêm trọng do việc đánh giá quá thấp mức độ ô nhiễm. Có tồn tại các phương pháp khác mà có thể được sử dụng để phát hiện coliform, và là những trạng thái khác nhau của sự phát triển và ứng dụng. Đánh giá này mô tả các nguyên GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 9 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm tắc và các cách thức thông thường của phương pháp cổ điển, cũng như một số các phương pháp đổi mới và phương pháp tiếp cận mới nổi. Việc ứng dụng các phương pháp khác nhau để phát hiện coliforms trong một môi trường nghèo chất dinh dưỡng như nước uống cũng được đánh giá dựa trên những ưu điểm và nhược điểm của chúng. Các tiêu chí như giới hạn phát hiện và độ nhạy của các phương pháp, thời gian cần thiết để có được kết quả và các kinh phí của phòng thí nghiệm (bao gồm cả kỹ năng, lao động và chi phí) cũng được thảo luận. 3. Phương Pháp Cổ Điển 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống Kỹ thuật để đếm coliforms bằng phương pháp lên men nhiều ống (MTF) đã được sử dụng hơn 80 năm như là một phương pháp kiểm tra chất lượng nước. Phương pháp này bao gồm việc cấy một loạt các ống với dung dịch pha loãng thập phân thích hợp của các mẫu nước. Tạo bọt khí, hình thành axit hoặc tăng trưởng nhiều trong ống nghiệm sau 48 giờ ủ ở 35 oC thì có thể là phản ứng dương tính. Cả môi trường dịch thể lactose và lauryl tryptose đều có thể được sử dụng như một môi trường nuôi cấy giả định, nhưng Seidler và các cộng sự (1981) và Evans và các cộng sự (1981) đã can thiệp, với số lượng lớn vi khuẩn không phải là coliform, thì sử dụng môi trường dich lỏng lactose. Tất cả ống có phản ứng dương tính giả định tiếp sau đó phải thực hiện một thử nghiệm khẳng định. Sự hình thành khí trong các ống lên men chứa môi trường brilliant green lactose bile tại bất kỳ thời điểm nào trong vòng 48 giờ ở 35oC tạo thành một thử nghiệm khẳng định dương tính. Các thử nghiệm coliform phân (sử dụng một môi trường canh EC) có thể được áp dụng cho xác định colifom tổng (TC) mà cụ thể là FC (APHA và các cộng sự, 1998): việc tạo khí sau 24 giờ ủ ở 44,5 oC trong canh EC được coi là một kết quả dương tính. Các kết quả của kỹ thuật MTF được thể hiện trong điều khoản số lượng có thể xảy ra nhất (MPN) về sự hiện diện của vi sinh vật. Con số này là một ước lượng thống kê của trung bình số coliform trong mẫu. Hệ quả là, kỹ thuật này được đưa ra GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 10 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm để định lượng sơ bộ coliforms. Tuy nhiên, độ chính xác của việc ước lượng thì thấp và phụ thuộc vào số ống dùng để phân tích: ví dụ, nếu chỉ 1 ml được xem xét trong một mẫu chứa 1 coliform / ml, khoảng 37% trong các ống 1 ml có thể mong đợi dự kiến sẽ mang lại kết quả âm tính vì các phân phối ngẫu nhiên của các vi khuẩn trong mẫu. Nhưng, nếu năm ống, mỗi 1 ml mẫu, được sử dụng, một kết quả âm tính có thể được dự kiến sẽ ít hơn 1% của thời gian (APHA và các cộng sự, 1998). Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đáng kể coliform đến phát hiện vi khuẩn bằng MTF, đặc biệt là trong suốt giai đoạn giả định. Sự can thiệp của một lượng lớn vi khuẩn không phải là coliform (Seidler et al, 1981; Evans và các cộng sự, 1981; Means và Olson, 1981), cũng như bản chất ức chế của môi trường (McFeters và các cộng sự, 1982), đã được xác định là yếu tố góp phần đánh giá thấp các coliform đa dạng. Kỹ thuật MTF thiếu chính xác về định tính và định lượng. Thời gian cần thiết để có được kết quả cao hơn so với các kỹ thuật khác. Kỹ thuật màng lọc đã thay thế kỹ thuật MTF trong nhiều trường hợp cho việc kiểm tra hệ thống nước uống. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn hữu ích, đặc biệt là khi điều kiện không cho phép sử dụng các kỹ thuật lọc màng, chẳng hạn như các loại nước đục hoặc có màu. MTF là dễ thực hiện và có thể được thực hiện bởi một kỹ thuật viên được đào tạo cơ bản về vi sinh, nhưng phương pháp này có thể trở nên rất dài dòng và cần nhiều nhân công vì nhiều dung dịch pha loãng đã được xử lý cho mỗi mẫu nước. Tuy nhiên, nó tương đối là không tốn kém, vì nó không đòi hỏi thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này là cực kỳ tốn thời gian, đòi hỏi 48h cho kết quả giả định, và buộc phải có một giai đoạn nuôi cấy lại để khẳng định mà có thể mất lên tới hơn 48h. 3.2. Kỹ thuật màng lọc Các màng lọc kỹ thuật (MF) đã hoàn toàn được chấp nhận và đã được phê duyệt như một thủ tục để theo dõi chất lượng vi sinh vật trong nước uống ở nhiều quốc gia. Phương pháp này bao gồm lọc một mẫu nước trên một màng lọc vô trùng GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 11 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm với kích thước lỗ 0,45 mm mà vẫn giữ lại vi khuẩn, ủ màng lọc này trên môi trường chọn lọc và đếm các khuẩn lạc điển hình trên các màng lọc. Nhiều môi trường và điều kiện ủ cho phương pháp MF được thử nghiệm cho việc phục hồi tối ưu của coliformstừ mẫu nước (Grabow và du Preez, 1979; Rice và các cộng sự, 1987). Trong đó, được sử dụng phổ biến cho phân tích nước uống là loại môi trường m-Endo ở Bắc Mỹ (APHA và các cộng sự, 1998) và môi trường Tergitol - TTC ở châu Âu (AFNOR, 1990). Vi khuẩn coliform hình thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim trên một môi trường loại Endo - loại môi trường có chứa lactose (ủ trong 24 giờ ở 35oC đối với TC) hoặc khuẩn lạc màu vàng – cam trên môi trường Tergitol-TTC (ủ trong 24 và 48 h ở 37 và 44 oC đối với TC và FC, tương ứng). Môi trường nuôi cấy khác, chẳng hạn như thạch MacConkey và môi trường Teepol, đã được sử dụng ở Nam Phi và Anh. Tuy nhiên, so sánh giữa các môi trường nuôi cấy thì thạch m-Endo mang lại giá trị đếm được cao hơn thạch MacConkey hoặc thạch Teepol (Grabow và du Preez, 1979). Để đếm các FC, APHA và các cộng sự (1998) cho rằng màng lọc được ủ trên môi trường làm giàu lactose (m-FC) ở nhiệt độ 44,5oC trong 24 giờ. Bởi vì nhiệt độ ủ tăng cao và việc bổ sung thuốc thử muối acid rosolic, vài khuẩn lạc không phải coliform phân phát triển trên các môi trường m-FC (APHA và các cộng sự, 1998). Việc đếm TC bằng cách lọc màng thì không hoàn toàn thiết thực. Khi MF được kết hợp với môi trường nuôi cấy m-Endo chứa lactose, các khuẩn lạc không điển hình thì có màu đỏ sẫm, nhầy hoặc có nhân và không có ánh kim thỉnh thoảng có thể xuất hiện. Khuẩn lạc không điển hình màu xanh, hồng, trắng hoặc không màu thiếu ánh thì không được xem trong TC trong kỹ thuật này (APHA và các cộng sự, 1998). Hơn nữa, các khuẩn lạc điển hình với một độ óng ánh đôi khi được tạo ra bởi vi khuẩn không phải là coliform và ngược lại, các khuẩn lạc không điển hình (màu đỏ sẫm hoặc khuẩn lạc có nhân mà không có ánh kim) thường không phải là coliforms. Do đó việc xác nhận Coliform có thể được chấp nhận cho cả hai loại khuẩn lạc (APHA và các cộng sự, 1998). GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 12 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Với việc chấp nhận MF như một kỹ thuật chọn lọc cho việc theo dõi nước uống (APHA và các cộng sự, 1998; AFNOR, 1990), các câu hỏi liên quan đến việc phát hiện coliform và tính chính xác của việc định lượng đã tăng lên. Sự hiện diện của số lượng lớn vi khuẩn dị dưỡng nền làm giảm việc hồi phục của coliform trong MF (Clark, 1980; Burlingame và các cộng sự, 1984). Các khuẩn lạc tập hợp quá lớn trên các môi trường m-Endo đã gắn liền với việc làm giảm các khuẩn lạc coliform tạo ra ánh kim (Hsu và Williams, 1982; Burlingame và các cộng sự, 1984). Điều đáng quan tâm về MF là nó không có khả năng để phục hồi coliforms bị căng thẳng hoặc bị tổn thương. Một số yếu tố hóa học và vật lý liên quan đến việc xử lý nước uống, bao gồm việc khử trùng, có thể gây ra thương vong cho vi khuẩn coliform, kết quả là một tế bào bị hư hỏng thì không thể hình thành một khuẩn lạc trên môi trường mang tính chọn lọc. Việc phơi sáng của vi khuẩn để tạo ra sản phẩm như clo có thể dẫn đến tổn thương và tăng tính nhạy cảm với muối mật hoặc các chất hoạt động bề mặt thay thế (sodium desoxycholate hoặc Tergitol 7) chứa trong một số môi trường nuôi cấy chọn lọc. Một số cải tiến trong phương pháp đã tăng độ phát hiện đối với vi khuẩn coliform bị tổn thương, bao gồm cả việc phát triển các môi trường m-T7 đặc biệt dành cho việc phục hồi của coliforms bị tổn thương trong nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983). Đánh giá thường xuyên về các mẫu nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983; McFeters et al, 1986) và nước bề mặt. (McFeters và các cộng sự, 1986; Freier và Hartman, 1987) cho thấy sự phục hồi coliform cao hơn trên môi trường m-T7 so với trên môi trường m-Endo. Tuy nhiên, m-T7 có thể không hiệu quả bằng m-Endo khi các bộ phận bị tổn thương khác chlorine có liên quan. Rice và các cộng sự (1987) đã đem lại sự khác biệt khôn đáng kể trong coliform đã phục hồi trên m-T7 so với m-Endo LES từ mẫu monochloraminated, và Adams và các cộng sự (1989) thấy rằng môi trường mT7 không tốt bằng môi trường m-Endo trong việc điều tra các tế bào E. coli và C. freundii tiếp xúc với ozone. Các tác giả khác đã gợi ý rằng việc khử trùng bằng clo ảnh hưởng đến các chức năng khác nhau về hoạt tính của vi khuẩn coliform, như hoạt tính enzym GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 13 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm catalase (Calabrese và Bissonnette, 1990; Sartory, 1995). Vi khuẩn hoat động trao đổi chất tạo ra hydrogen peroxide (H2O2), việc này thường nhanh chóng bị thoái hóa bởi catalase. Coliforms bị thương với hoạt tính của catalase giảm sẽ tích lũy chất độc hydrogen peroxide, mà chúng thì cực kỳ nhạy. Calabrese và Bissonnette (1990) báo cáo về sự tăng lên trong việc phục hồi coliform trên môi trường nuôi cấy mEndo và m-T7, cũng như sự gia tăng trong việc phục hồi E. coli trên m-FC khi các môi trường nuôi cấy được bổ sung catalase, sodium pyruvate hoặc cả hai. Sartory (1995) cho rằng sodium pyruvate nên được thêm vào ở nồng độ 0,01-0,1% cho bất kỳ môi trường phát hiện coliform chuẩn nào vì sản phẩm này cho phép cải thiện việc phục hồi của các coliform chịu áp lực chlorine. Số lượng lớn môi trường nuôi cấy thay đổi trong sử dụng là một phản ánh thực tế rằng không có môi trường thông dụng nào hiện nay tồn tại cho phép tối ưu việc đếm các loài coliform khác nhau có nguồn gốc từ các môi trường khác nhau và hiện diện ở nhiều trạng thái sinh lý. Những lợi ích đáng kể của kỹ thuật MF nhiều hơn là phương pháp MTF, việc kiểm tra các thề tích lớn của nước là khả thi, nhạy hơn và độ tin cậy cao hơn. MF cũng là một điều tra định lượng mang tính tương đối với việc định lượng sơ bộ các thông tin được ghi nhận bởi phương pháp MTF. MF là một kỹ thuật hữu ích cho đa số các phòng thí nghiệm về chất lượng nước vì nó là một phương pháp tương đối đơn giản để sử dụng. Nhiều mẫu có thể được xử lý trong một ngày với các thiết bị phòng thí nghiệm bị hạn chế bằng một kỹ thuật với các kỹ năng vi sinh cơ bản . Tuy nhiên, vì phương pháp này thì chưa đủ thiết thực, một giai đoạn khẳng định là cần thiết, mà nó có thể mất hơn 24 h sau giai đoạn ủ đầu tiên trên môi trường chọn lọc. Đây là lý do tại sao việc cải tiến phương pháp MF dựa trên các thuộc tính enzyme của coliforms đã được đề xuất (xem mục 4.3). 4. Phương Pháp Enzyme 4.1 Nguyên tắc chung Các xét nghiệm sinh hóa được sử dụng để xác định vi khuẩn và liệt kê các phương pháp nuôi cấy cổ điển thường được dựa trên các phản ứng trao đổi chất. Kết GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 14 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm luận này, chúng không hoàn toàn cụ thể, và nhiều xét nghiệm bổ sung này đôi khi cần thiết để có được xác nhận chính xác. Việc sử dụng các enzyme của vi khuẩn để phát hiện vi khuẩn là một thay thế hấp dẫn đối với các phương pháp cổ điển. Phản ứng enzyme có thể là nhóm, chi hoặc loài cụ thể, tùy thuộc vào enzyme mục tiêu.Hơn nữa, phản ứng nhanh và nhạy cảm.Như vậy, khả năng phát hiện và liệt kê coliforms thông qua các hoạt động enzyme cụ thể đã được điều tra nhiều năm nay. β-D-glucuronidase là một enzyme xúc tác thủy phân dẫn xuất β-Dglucopyranosiduronic vào aglycons tương ứng của chúng và acid D-glucuronic. Mặc dù enzyme vi khuẩn này được phát hiện đầu tiên trong E. coli, độ đặc hiệu tương đối của nó để xác định các vi sinh vật này là không rõ ràng cho đến khi Kilian và Bulow (1976) khảo sát các Enterobacteriaceae và báo cáo rằng hoạt động glucuronidase chủ yếu là giới hạn E. coli. Sự phổ biến của enzyme này và tiện ích của nó trong việc phát hiện vi khuẩn E. coli trong nước sau đó đã được xem xét bởi Hartman (1989). Phản ứng B-D-glucuronidase dương tính đã được quan sát trong 94- 96% của E. coli phân lập được thử nghiệm (Kilian và Bulow, 1976; Feng và Hartman, 1982; Edberg và Kontnick, 1986;. Kaspar và cộng sự, 1987), trong khi Chang và cộng al. (1989) tìm thấy một tỷ lệ cao hơn của B-D-glucuronidaseE. coli âm tính (thời gian trung bình là 15% từ vi khuẩn E. coli phân lập từ mẫu phân của con người). Ngược lại, hoạt động B-D-glucuronidase là ít phổ biến hơn trong chi Enterobacteriaceae khác, chẳng hạn như vi khuẩn Shigella (44-58%), Salmonella (20-29%) và chủng Yersinia và Flavobacteria (Kilian và Bulow, 1976; Massanti et al ., 1981; Feng và Hartman, 1982; Frampton và Restaino, 1993). B-Dgalactosidase, xúc tác sự phân hủy của lactose thành glucose và galactose và đã được sử dụng chủ yếu để liệt kê các nhóm coliform trong họ Enterobacteriaceae. Việc sử dụng B-D-glucuronidase và các hoạt động B-D-galactosidase để phát hiện và đếm vi khuẩn E. coli và TC tương ứng, được xem xét ở đây. Chromogenic và chất fluorogenic sản xuất màu và huỳnh quang, tương ứng khi chia tách bởi một enzyme cụ thể.Các chất đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện hoặc các hoạt động của enzyme cụ thể trong các hệ thống thủy sản (Chrost, GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 15 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 1991). Một số tác giả đã xem xét chất fluorogenic và chromogenic được sử dụng để chẩn đoán vi khuẩn (Bascomb, 1987; Manafi et al, 1991.). Họ lưu ý rằng việc sử dụng các chất đã dẫn đến cải thiện độ chính xác và phát hiện nhanh hơn.Phương pháp phát hiện hoặc điều tra có thể được thực hiện trong một môi trường duy nhất, do đó bằng cách thông qua sự cần thiết của một thủ tục tốn thời gian cách ly trước khi xác định. Để phát hiện sự hiện diện của B-D-glucuronidase trong E. coli, các chất nền chromogenic sau đây được sử dụng:(Brenner và cộng sự, 1993) indoxyl-BD-Glucuronide (IBDG), các phenolphthalein-mono-B-D-glucuronide phức tạp (Butle và SBS, 1989) và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide (X-Glu) (Watkins et al, 1988).Thường xuyên nhất, các chất nền fluorogenic 4 methylumbelliferyl-B-D-glucuronide (MUGlu) đã được sử dụng (Dahlen và Linde, 1973; Feng và Hartman, 1982). Chất Chromogenic như o-nitrophenyl-B-Dgalactopyranoside (ONPG), p-nitrophenyl-B-D-galactopyranoside (PNPG), 6bromo-2-naphtyl-B-D-galactopyranoside (burger, 1967) và 5-bromo -4-chloro-3indolyl-BD-galactopyranoside (X-Gal) (Ley et al., 1993) đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của B-D-galactosidase sản xuất bởi coliforms, cũng như chất phát quang bề mặt 4 -methylumbelliferyl-B-D-galactopyranoside (MUGal). 4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme Sự kết hợp của MUGlu vào lauryl tryptose broth sử dụng như một môi trường nuôi cấy cho quá trình lên men nhiều ống (MTF) kỹ thuật lần đầu tiên được đề xuất để phát hiện nhanh chóng và xác nhận ngay lập tức E. coli trong thực phẩm và mẫu nước (Feng và Hartman, 1982). Sự hiện diện của methylumbelliferone do sự thủy phân của MUGlu (mẫu dương tính) đã được phát hiện bởi sự tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím sóng dài và trực quan của sự phát huỳnh quang màu xanh-trắng. Một số tác giả đã sử dụng spectrofluorometer hoặc một quang phổ (Park et al, 1995.) (Standridge et al, 1992; Apte et al, 1995) để giảm ngưỡng phát hiện huỳnh quang và do đó làm giảm thời gian ủ bệnh. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 16 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Dựa vào tính chất enzyme của vi khuẩn, một phương pháp xác định chất nền được phát triển để khắc phục một số hạn chế của MTF và kỹ thuật MF. Không giống như các phương pháp này, trong đó loại bỏ sự phát triển của vi khuẩn khôngphải coliform với hóa chất ức chế, công nghệ bề mặt được xác định dựa trên nguyên tắc rằng chỉ có các vi khuẩn mục tiêu (TC và E. coli) được cung cấp và không được cung cấp chất nền cho các vi khuẩn khác. Một bề mặt được định nghĩa được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng quan trọng đối với các vi khuẩn mục tiêu. Trong quá trình sử dụng chất nền, một nhiễm sắc hoặc một fluorochrome được phát triển từ bề mặt, cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu. Edberg và Edberg (1988) đề xuất sử dụng công nghệ bề mặt kết hợp với chất nền ONPG cho các enzyme b-galactosidase có mặt trong tất cả các vi khuẩn và MUGlu chất nền cho việc phát hiện cụ thể của E. coli. Phương pháp xác định chất nền cơ bản đã được thành lập như là một kiểm tra sự hiện diện, sự vắng mặt.Các ống, cái mà sao khi thêm mẫu vẫn không màu.Ngoài ra, được ủ ở 35 oC.Bất kỳ màu vàng trong ống nghiệm (chỉ ra quá trình thủy phân của ONPG) được coi là dương tính đối với TC. Bất kỳ ống vàng được tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím bước sóng dài, và huỳnh quang màu xanh-trắng thể hiện sự hiện diện của vi khuẩn E. coli. Không có thử nghiệm xác nhận bổ sung cần phải được thực hiện. Thí nghiệm đầu tiên (Edberg và Edberg, 1988) chứng minh rằng kiểm tra các chủng môi trường của TC và E. coli cho thấy độ nhạy tương đương với các phương pháp cổ điển (lên đến 1 CFU / 100 ml) với đặc trưng có khả năng lớn hơn. Dữ liệu cũng xác nhận khả năng phát hiện vi khuẩn bị thương với thời gian đáp ứng tối đa 24 giờ. Rice et al. (1990, 1991) sử dụng nhiều chủng tinh khiết của vi khuẩn E. coli để xác định hiệu quả của công nghệ phát hiện chất nền được định nghĩa với B-Dglucuronidase và cho thấy kết quả tích cực (95,5% chủng B-D-glucuronidase dương tính trong 24 giờ và 99,5% dương tính sau 28 giờ ủ). Không có E. coli phân lập dương (Rice et al., 1990). Một số xét nghiệm thương mại sau đó được phát triển dựa trên công nghệ bề mặt được xác định: Colilert (IDEXX phòng thí nghiệm, Portland, ME, Mỹ), GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 17 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Colisure (công ty Millipore, Bedford, MA, USA), ColiQuick (Hach, Loveland, CO, USA). Hầu hết trong số này là có sẵn cho một phản ứng sự hiện diện/sự vắng mặt và đếm bằng kỹ thuật nhiều ống.Sử dụng rộng rãi nhất trong số đó là thử nghiệm Colilert, trong đó sử dụng các kỹ thuật bề mặt được chỉ rõ tính chất với ONPG và MUGlu.Rất nhiều và rất rộng rãi so sánh giữa những thử nghiệm thương mại và MTF cổ điển và phương pháp tiếp cận MF đã được thực hiện để liệt kê TC và E. coli trong các loại nước (Edberg và cộng sự, 1988, 1989, 1990.Clark và cộng sự, 1991. Olson và cộng sự năm 1991, McCarty và cộng sự, 1992;McFeters et al, 1993;. Palmer và cộng sự, 1993; Clark và ElShaarawi năm 1993; Colquhuon et al, 1995; Fricker và Fricker, 1996). Kết luận chính của các nghiên cứu này là những thử nghiệm có hiệu quả để phát hiện các vi khuẩn từ nhiều nguồn nước khác nhau, thường là nhạy cảm như là cách tiếp cận MTF để phát hiện vi khuẩn E. coli và đôi khi nhạy cảm hơn để phát hiện các TC. Gần đây, QuantiTray (QT) (IDEXX), mà là một phiên bản mở rộng của MPN kiểm tra Colilert (một phiên bản MPN với một số giới hạn các ống cũng đã được thương mại hóa ở giai đoạn đầu), được so sánh với các phương pháp MF, đặc biệt là mẫu nước uống, bởi Fricker et al. (1997), De Roubin et al. (1997) và Eckner (1998). Tất cả họ đều kết luận không có sự khác biệt đáng kể cho việc đếm E. coli giữa các phương pháp QT và MF, trong khi khả năng phục hồi của TC lớn hơn với kỹ thuật QT hơn so với phương pháp MF. McFeters et al. (1997a, b) tham khảo các tiêu chuẩn so sánh với các phương pháp thử nghiệm Colisure để phát hiện vi khuẩn chịu clo: với Colisure, thu hồi TC và E. coli bị tổn thương bởi clo được cải thiện hơn các phương pháp tiêu chuẩn, kết quả là một ước tính thực tế hơn vềchỉ số vi khuẩn trong nguồn cung cấp nước công cộng. Trong kết luận, kiểm tra dựa trên công nghệ bề mặt được xác định bằng cách sử dụng chất chromogenic và fluorogenic được áp dụng cho việc phát hiện và định lượng Coliform và E. coli trong nước uống. Các xét nghiệm này dễ sử dụng và cung cấp cho một ước tính nhanh hơn và thực tế hơn (đặc biệt là sự hiện diện của Clo dư) các chỉ số ô nhiễm vi khuẩn trong nước hơn so với trường hợp không có sự hiện diện cổ điển hay MTF. Những phương pháp này có thể tốn kém hơn so với phương GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 18 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm pháp cổ điển khi sau này không cần các bước xác nhận bổ sung. Khi bước xác nhận được yêu cầu, các chi phí phát sinh trong cả hai phương pháp là tương đương. Trong mọi trường hợp, phương pháp enzyme đòi hỏi nhân lực ít hơn và do đó chi phí của họ về giá trị thương mại thấp hơn. 4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn Dahlen và Linde (1973) đánh giá sự kết hợp của MUGlu vào môi trường thạch để phát hiện sự hiện diện của hoạt động B-D-glucuronidase (E. coli). Brenner et al. (1993) đã phát triển môi trường thạch MI, có chứa các MUGal fluorogenic và IBDG chromogenic, đồng thời phát hiện TC và E. coli trong nước. Phương pháp này đã được chứng minh là nhạy cảm, chọn lọc, cụ thể và nhanh chóng (kết quả có sẵn trong 24 h) (Brenner và cộng sự, 1996.). Gaudet et al. (1996) và Ciebin et al. (1995) liên quan MUGlu hoặc X-Glu với cổ điển m-TEC và thạch lauryl tryptose và so sánh với các phương pháp hiện đại thay đổi với các phương pháp cổ điển. Các môi trường hiện đại thay đổi môi trường thạch thường cho thấy sự phục hồi cao hơn hoặc tương tự như của TC và E. coli. Các môi trường nuôi cấy thương mại đang có sẵn để phát hiện các TC và E. coli. Chúng bao gồm các môi trường nuôi cấy môi trường thạch cổ điển được sử dụng cho E. coli và Coliform với các chất nền chromogenic và / hoặc fluorogenic cụ thể để phát hiện các B-D-glucuronidase và / hoặc B-D-galactosidase: thạch Chromocult Coliform (Merck, Darmstadt, Đức), thạch Fluo-rocult E. coli trực tiếp (Merck) và m-ColiBlue24 broth (Hach) (Grant, 1997). Việc sử dụng các phương pháp đếm đĩa, bao gồm cả chất chromogenic và / hoặc fluorogenic, cho phép nhiều hơn, nhanh chóng, dễ dàng hơn và các ước tính chính xác hơn về coliform và E.coli rất nhiều trong nước uống hơn so với việc sử dụng các phương pháp cổ điển. Chúng có thể được sử dụng bởi bất kỳ phòng thí nghiệm, có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, có nhiều tốn kém và giải quyết không thỏa đáng các vấn đề liên quan đến sự hiện diện của vi khuẩn chỉ thị không nuôi cấy. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 19 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry Các phương pháp mô tả ở trên là dựa trên nuôi cấy để kiểm tra và vẫn thường đòi hỏi từ 18 đến 24 giờ để hoàn thành.Gần đây hơn, B-D-galactosidase và B-D-glucuronidase thuộc tính của TC và E. coli đã được khai thác trên nước ngọt (Berg và Fiksdal, 1988; George và cộng sự, 2000.)Và mẫu nước biển (Davies và cộng sự, 1995.) xét nghiệm nhanh chóng mà không cần bất kỳ bước nuôi cấy nào. George và cộng sự.(2000) hoàn thành một biên bản dựa trên nền fluorogenic MUGal và MUGlu cho một phát hiện enzyme trực tiếp của FC trong nước ngọt trong 30 phút. Những phương pháp này cho phép ước tính nhanh chóng và trực tiếp về mức độ ô nhiễm vi sinh nguồn nước mặt, nhưng giới hạn phát hiện của họ (20 CFU / 100 ml cho FC khoảng 340 CFU / ml cho 100 TC) ngăn cản việc sử dụng chúng để theo dõi nước uống. Một phân tích tự động (Colifast CA-100 (Colifast Systems, Oslo, Na Uy)) đã được phát triển trên cơ sở các thuộc tính enzyme của vi khuẩn (Ofjord et al, 1998; Berg và cộng sự, 1998.). Các mẫu được ủ (sau khi tập trung bằng cách lọc, nếu cần thiết) ở 37oC cho TC và 44oC FC trong một môi trường phát triển có chọn lọc cho coliforms và chứa MUGal. Nếu số lượng coliform trong mẫu là đủ, sự gia tăng huỳnh quang do MUGal thủy phân bởi các vi khuẩn hiện nay có thể được đo trong vòng chưa đầy 2 giờ. Nếu không, việc phát hiện một tín hiệu huỳnh quang quan trọng đòi hỏi sự phát triển của vi khuẩn trước. Việc phát hiện một môi trường nuôi cấy TC mất khoảng 11 giờ.Phương pháp này là như vậy, một quyết định trực tiếp của các hoạt động enzyme cho mẫu với coliform cao (nước mặt) và liên quan đến một giai đoạn tăng trưởng cho các mẫu với coliform thấp (nước uống). Các thử nghiệm Coli nhanh thường khuyến khích nhiều hơn cho nước tắm, và tiếp tục phân tích được thực hiện trong nước uống với phân tích này và các phương pháp khác vẫn được yêu cầu nếu kết luận được rút ra. Tuy nhiên, kể từ khi phân tích nước uống với các phân tích Coli nhanh đòi hỏi một giai đoạn tăng trưởng, hệ thống này sẽ không thể phát hiện vi khuẩn không nuôi cấy. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 20 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn Chỉ tiêu đáng kể gần đây đã tập trung vào sự phát triển của phương pháp enzyme nhanh chóng áp dụng cho nước uống với mục tiêu đạt kết quả trong lịch trình một ngày làm việc của Văn Poucke và Nelis (1999) đánh giá phát hiện công cụ tín hiệu huỳnh quang để giảm thời gian phân tích của một màng enzyme kiểm tra lọc. Họ đã sử dụng một thiết bị quét laser (ScanRDI1-Chemunex, Ivry-sur-Seine, Paris, Pháp) trong đó phát hiện và liệt kê số lượng thấp của các tế bào huỳnh quang được kí hiệu bằng một kĩ thuật đếm tế bòa pha rắn (Brails-ford, 1996). Hệ thống này cung cấp một giới hạn phát hiện định lượng trực tiếp rất thấp cho phép phát hiện từ 1 đến 1000 tế bào có kí hiệu huỳnh quang phân phối trên màng. Sử dụng hệ thống này, Văn Poucke và Nelis (1999b) đề xuất một thử nghiệm cho phép phát hiện vi khuẩn E. coli và TC trong khoảng 3.5 h, về nguyên tắc cũng bao gồm các tế bào trao đổi chất hoạt động nhưng không nuôi cấy. Nguyên tắc của phương pháp cho các tế bào vi khuẩn E. coli như sau (Văn Poucke và Nelis, 1999b, 2000a): E. coli hiện diện trong mẫu nước uống được giữ lại trên một bộ lọc 0.4mm sau khi lọc chân không. Các tế bào E. coli bị mắc kẹt được điều trị bằng hóa chất để tạo ra các enzyme B-D-glucuronidase (3 giờ ở 37oC) và có kí hiệu (0,5 giờ ở0 oC) các tế bào gây ra. Chỉ có B-D-glucuronidase của E. coli có thể được gây ra và do đó chỉ những vi khuẩn tách các chất nền không huỳnh quang (fluorescein-di-B-D-glucuro-nide), giữ lại huỳnh quang sản phẩm cuối cùng bên trong tế bào. Sự phát huỳnh quang của một tế bào đơn lẻ hoặc một khuẩn lạc nhỏ (mà có khả năng phát huỳnh quang) được phát hiện bởi các thiết bị ScanRDI1: quét laser qua màng cho phép đếm số tế bào huỳnh quang trong 3 phút. Một xác nhận hình ảnh của phát huỳnh quang được thực hiện bằng cách chuyển màng đến một kính hiển viepi-fluorescence được gắn với một giai đoạn cơ giới hóa được điều khiển bởi phần mềm ScanRDI1. Quy trình phát hiện các TC là tương tự, nhưng fluorescein-di-B-D-galactoside được sử dụng như là chất nền, cho phép phát hiện các B-D galactosidase (Văn Poucke và Nelis, 2000b). GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 21 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Áp dụng các phương pháp đề xuất cho E. coli và TC ô nhiễm một cách tự nhiên và nước giếng bị ô nhiễm, nước mặt và khai thác các mẫu nước đã chỉ ra hơn 90% vi khuẩn E. coli và hơn 92% lượng TC và tương đương với phương pháp tham khảo bao gồm thạch MFC (E. coli), thạch m-Endo (TC) và thạch Chromocult Coliform (E. coli và TC) (Văn Poucke và Nelis, 1999a, b, 2000a, b). Tính so với trung bình thứ hai, tỷ lệ âm tính giả là 3% đối với E. coli và 3,2% cho TC. Trong một số lượng hạn chế của mẫu, số lượng thấp (1 -3) của các sinh vật mục tiêu đã được phát hiện bằng cách quét laser và không phải bởi số lượng đĩa thông thường. Nếu những kết quả này được xác nhận trong tương lai, phương pháp này chắc chắn sẽ được quan tâm do thời gian ngắn cần thiết để phân tích một mẫu nước. 4.6. Kết luận về phương pháp enzyme Bổ sung chất fluorogenic và chromogenic vào môi trường nuôi cấy (agar và môi trường lỏng) để phát hiện hoạt động enzyme của TC và E. coli đã tăng độ nhạy và tốc độ nhanh chóng hơn các phương pháp cổ điển để ước lượng vi sinh vật trong nước uống. Mặc dù một số các xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn bịtổn thương, nhưng chúng không phù hợp để giải quyết vấn đề của việc phát hiện các tế bào không nuôi cấy.Việc phát hiện vi khuẩn huỳnh quang của đếm tế bào pha rắn là một cách đáng quan tâm để giảm lượng thời gian cần thiết đểđạt được kết quả, nhưng phương pháp này đòi hỏi một tế bào kế pha rắn. 5. Phương Pháp Phân Tử Phương pháp phân tử đã được phát triển để tăng nhanh chóng tốc độ của phân tích. Phương pháp nàycó thể đạt được một mức độ cao của độ nhạy và độ đặc hiệu mà không cần một canh tác phức tạp và bổ sung thêm các bước xác nhận. Do đó, những phương pháp này cho phép phát hiện các vi khuẩn có( khả năng và/ hoặc không nuôi cấy) cụ thể trong vòng vài giờ, thay vì vài ngày vớiyêu cầu các phương pháp truyền thống. Một số phương pháp phân tử áp dụng cho việc phát hiện cụ thể của Coliform trong nước và nước uống sẽ được thảo luận ở đây. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 22 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 5.1. Phương pháp miễn dịch Phương pháp miễn dịch dựa trên ghi nhận cụ thể giữa kháng thể và kháng nguyên và các mối quan hệ cao, đó là đặc trưng của phản ứng công nhận này. Tùy thuộc vào mức độ phân loại các kháng nguyên mục tiêu, phương pháp miễn dịch cho phép phát hiện các kháng nguyên ở phân loài, chi, loài hoặc mức type huyết thanh. Có hai loại kháng thể có thể được sản xuất: kháng thể đơn dòng và đa dòng, nào là cụ thể hơn để các sinh vật mục tiêu. Các đặc tính của phức kháng nguyên kháng thể có thể được sử dụng:  Để thực hiện một miễn dịch bắt cặp( immunocapture) của các tế bào hoặc các kháng nguyên bởi liên kết enzyme xét nghiệm miễn dịch (IMS hoặc ELISA), hoặc  Để phát hiện các tế bào mục tiêu của thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IFA) hoặc miễn dịch enzyme khảo nghiệm (IEA). Hơn 10 năm qua, phương pháp miễn dịch đã được nỗ lực thực hiện để sử dụng để phát hiện các chỉ tiêu chất lượng nước trong nước uống.Obst et al. (1989) đã phát triển một phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại các kháng nguyên enterobacterial chung (ECA), mộtloạilipopolysaccharide , được liên kết trong màng ngoài của Enterobacteriaceae. Phương pháp này không đủ nhạy , tuy nhiên, do đónuôi cấy mẫu trước trong một canh chọn lọc trong 24 giờ là cần thiết để định giới hạn phát hiện của phương pháp ELISA (100.000 tế bào / ml) có thể đạt được. Hubner et al. (1992) tìm ra ELISA với kháng thể đơn dòng ECA để phát hiện thường xuyên của Enterobacteriaceae và cho thấy một mức độ tương tự 98% với phương pháp tiêu chuẩnTC (lên men nhiều ống). Levasseur et al. (1992) đã phân tích thấu đáo tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng ECA sau khi sàng lọc 259 chủng Enterobacteriaceae và 125 vi khuẩn Gram âm khác. Họ phát hiện ra phản ứng chéo (cross-reactivity) với những nhóm khác, chủng khác nhau của AeroMonas, đó là đối thủ cạnh tranh quan trọng để vi khuẩn Coliform phát triển trên môi trường nuôi cấy m-Endo .Phản ứng dương tính giảcùng đã được báo cáo bởi Hubner et al. (1992), người đã đề cập đến phản ứng chéo với một số vi khuẩn Gram âm(Pseudomonas và GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 23 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Aeromomas) và vi khuẩn Gram dương(Bacillus) , khi kháng thể đơn dòng ECA được sử dụng để phát hiện Enterobacteriaceae. ELISA là một thử nghiệm nhanh chóng, đơn giản và khá nhạy cảm, cho phép phát hiện ít hơn 10 -9 g protein kháng nguyên (Stryer, 1988). Tuy nhiên, khảo nghiệm có giới thường phụthuộc vào tính đặc hiệu của kháng thể được sử dụng, nồng độ của cả hai kháng thể và kháng nguyên và các loại dung dịch phản ứng được sử dụng.Ngoài ra, chất nền mẫuthường dẫn đến liên kết không đặc hiệu của kháng nguyên hoặc kháng thể thứ hai (Kfir và Genthe, 1993). Phương pháp này rất hữu ích để kiểm tra kháng thể đơn dòng hoặc phát hiện vi sinh vật tăng vọt. Tuy nhiên, ứng dụng của nó để phát hiện các tế bào cụ thể từ một mẫu bị ô nhiễm tự nhiên bị giới hạn (Hanai et al, 1997.).Mức độ của các đặc trưng của phương pháp ELISA có thể can thiệpmức độ cao của hệ vi và thợ lặn tài liệu không có mục tiêu liên quan đến mẫu . Khảo nghiệm miễn dịch huỳnh quang cho phép xác định và đếm một tế bào cụ thể duy nhất trong một mẫu tự nhiên (Campbell, 1993).Xét nghiệm có thể được thực hiện bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp .Trong phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, các kháng thể đặc biệt là liên hợp trực tiếp với một fluorochrome.Phương pháp gián tiếp liên quan đến sự liên kết của các kháng thể chính cụ thể đối với kháng nguyên mục tiêu tiếp theo là việc bổ sung một kháng thể được đánh dấu fluorochrome trực tiếp chống lại các kháng thể đầu tiên. Ưu điểm của cách làm này là các kháng thể thứ cấp có thể dễ dàng được lấy từ một nhà cung cấp thương mại với một loạt các fluorochromes liên hợp (Hoff, 1993). Phương pháp xác định huỳnh quang tế bào nhanh chóng có thể đạt được bằng cách sử dụng kính hiển vi epifluorescence hoặc pha rắn đếm tế bào sau khi lọc của mẫu nước, hoặc bởi dòng cytometry. Zaccone et al. (1995) áp dụng một xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trên màng cho việc đánh giá ô nhiễm phân trong các mẫu từ vùng nước ven biển và hồ. Họ so sánh FC phục hồi efficien- các chính IFA đạt được bằng cách epifluorescence kính hiển vi và phương pháp MF và cho thấy cao hơn IFA CFU tính 2 bậc độ lớn. Tuy nhiên, họ đã báo cáo sự tồn tại của một ngưỡng dưới GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 24 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm đây mà các phương pháp IFA không thể được áp dụng (khi vi khuẩn cụ thể là dưới 1% tổng dân số) và chủ yếu liên quan đến các hạt can thiệp nội dung, khi khối lượng lớn được lọc. Trong khi IFA cho phép xác định cụ thể và phát hiện ở mức độ đơn bào, nó không cung cấp những thông tin về tình trạng sinh lý của tế bào, hoặc cho dù Vi sinh vật đang sống hay đã chết. Một sáng tạo xét nghiệmmiễn dịch huỳnh quang được phát triển bởi Rockabrand et al. (1999), trong đó xác định tình trạng sinh lý của tế bào bằng proteinđịnh hình trong giai đoạntăng trưởng cụ thể. Sự khác biệt của giai đoạn phát triển coliform được dựa trên sự hiện diện của baprotein nội bào( protein cytosolic): DnaK, một loại protein trao đổi chất ổn định; Dps, một protein quan trọng trong phaổn định hoặc các tế bào không tạm nghỉ ,Dpstương quan nghịch với tốc độ tăng trưởng; và Fis, mà đóng một vai trò quan trọng trong việc điều phối tổng hợp rRNA với tăng trưởng. Định lượng protein nộibào( cytosolicprotein)được thực hiện bằng cách sử dụng Enterobacteria fluorochrome nhãn kháng thể đơn dòng (kháng DnaK, kháng Dps và kháng Fis). Các đặc trưng của kháng thể thử nghiệm đã được kiểm tra bằng cách so sánh kết quả với những người thu được từ thử nghiệm 16S rRNA cụ thể với Enterobacteriaceae (Mittelman et al, 1997.) Trên các môi trườngthuần túy của sáu Enterobacteriaceae và một thành viên khác của phân gamma của lớp con Proteobacteria. Đồng thời thăm dò các mẫu nước thải với các kháng thể và DnaKOligonucleotide 16S rRNA cho thấy cả phương phápđã cho kết quả tương tự. Theo hiểu biết của chúng tôi, những kháng thể đặc hiệu chưa được áp dụng để phát hiện các vi khuẩn trong nước uống. Hạn chế chính của phương pháp miễn dịch áp dụng cho giám sát chất lượng nước uống được liên hệ với số lượng rất thấp của các tế bào mục tiêu trong các mẫu. Phân tích thực hiện trên số lượng lớn các mẫu nước lọc có giới hạn, tùy thuộc vào dung tích(Faude và Hofle năm 1997; Hanai và cộng sự, 1997). Tuy nhiên,Định lượngcác tế bào cụ thể pha loãng có thể thu được bằng phương pháp tách immunomagnetic (IMS, Dynal). Phương pháp này sử dụng hạt từ tính được phủ các GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 25 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm kháng thể đơn dòng hoặc đa giá, làm cho nó có thể làm giảm nền mẫu liên quan đến bằng cách lọc và tập trung các tế bào mục tiêu. Mặc dù phương pháp IMS đã được áp dụng rộng rãi để phát hiện số lượng thấp của các tế bào từ các mẫu thực phẩm (Peng và Shelef năm 1999; Mansfield và Forsythe, 2000), một vài nghiên cứu báo cáo như thế nào nó thực hiện trên mẫu nước uống. Gần đây, Pyle et al. (1999) đề xuất một sự kết hợp của IMS và giai đoạn solid- tia laser đếm tế bào cho một phát hiện nhạy cảm của vi khuẩn E. coli O157: H7 tăng vọt trong nước.bước Làm sạch và côđặc đã được thực hiện bằng cách sử dụng hạt supermagnetic phủ chống O157 huyết thanh thỏ và một tách từ tính, làm cho nó có thể loại bỏ các tế bào cố định trên hạt từ mẫu. Họ đã thực hiện phân tích khác nhau trên các tế bào loại bỏ, chẳng hạn như địnhlượng các tế bào nuôi cấy và các tế bào hô hấp . Tế bào nuôi cấyđược liệt kê bởi MF và xác định bởi một phương pháp IFA trực tiếp kết hợp với phát hiện ScanRDI1. Phương pháp tiếp cận nhiều giai đoạn này áp dụng trên mẫu nước nhọn cho thấy một mức độ cao hơn của sự nhạy cảm hơn so với phương pháp dựa trên nuôi cấy Việc sử dụng các phương pháp miễn dịch cho việc pháthiện vi sinh vật cụ thể là một kỹ thuật nhanh chóng và đơn giản, độ chính xác trong đó chủ yếu là phụ thuộc vào đặc trưng của kháng thể (Kfir và Genthe, 1993). Một cách để tăng độ đặc hiệu là lựa chọn kháng thể đơn dòng có độ cụ thể trong tương táclại một epitope cụ thể. Tuy nhiên, kể từ khi một epitope có thể có mặt trong hơn một thuốc kháng nguyên, một thử nghiệm đặc hiệu nghiêm ngặt của các kháng thể đơn dòng tổng hợp với các chủng vi khuẩn liên quan chặt chẽ và xa phải đi trước thường xuyên các mẫu môi trường. Nhiều khả năng do cho vấn đề này có phản ứng chéo với các chủng vi khuẩn khác, việc sử dụng các phương pháp miễn dịch để phát hiện E.coli và coliforms vẫn chưa thành công. Hơn nữa, ở kiến thức của chúng tôi, các kháng thể thực để chống lại tất cả các chủng môi trường của vi khuẩn E. coli không tồn tại vào thời điểm này. Việc áp dụng các kháng thể đơn dòng để phát hiện các sinh vật cụ thể trong một môi trường tự nhiên, đặc biệt là các vi khuẩn trong nước uống, có thể cần điều tra phức tạp hơn hướng về kháng thể đặc hiệu và sự phong phú của vi GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 26 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm khuẩn trong một mẫu nước uống. Bởi vì kháng thể đơn dòng có khoảng đặc trưng giống như các đầu dò oligonucleotide 16S rRNA và vì sự saûn của họ là nhiều hơn mất thời gian, không có lợi thế để sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trong phương pháp lai tại chỗ (FISH) (xem phần sau). Một trong những lợi ích FISH sẽ đạtđược trong việc sử dụng của một kháng thể như chống Fis (Rockabrand et al., 1999) sẽ phân biệt tình trạng sinh lý của vi khuẩn được phát hiện trong mẫu nước. 5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic Hầu hết các phương pháp sử dụng acid nucleic tính lai phân tử, trong đó có việc công nhận trình tự bổ trợ giữa thực nghiệmnucleic và một mục tiêu nucleic.thăm dò và mục tiêu nucleic. Một phản ứng lai có thể được thực hiện giữa một tàu thăm dò nucleic DNA và một chuỗi DNA chromosomic (DNA - DNA hybrid- hóa) hoặc một rRNA hay tRNA tự (DNA - RNA lai). Đặc hiệu, ở đây, phụ thuộc vào mức độ - bảo tồn các mục tiêu trong nhóm mục tiêu phân loại. Những phương pháp này cung cấp thông tin phân loại ở các cấp độ khác nhau, chẳng hạn như các lớp học, chi, loài hoặc phân loài. Một số trong số họ có thể được thực hiện mà không cần một bước canh tác phức tạp, do đó cho phép phát hiện các vi khuẩn cụ thể trong vòng vài giờ, thay vì vài ngày cần thiết với các phương pháp canh tác dựa trên. Các phương pháp dựa trên nucleic acid thường xuyên hơn là sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và các phương pháp lai tại chỗ (ISH). Đánh giá hiệu suất của họ trong việc phát hiện vi khuẩn trong các mẫu nước uống được thảo luận dưới đây. 5.2.1. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase PCR cho phép một đoạn DNA mục tiêu được khuếch đại bằng cách sao chép vòng (cycling replication). Sao chép này, có thể được thực hiện trong ống nghiệm(in vitro) hoặc tại chỗ(in situ), bao gồm một chuỗi phản ứng xúc tác bởi một DNA polymerase (Taq polymerase) và sử dụng các mồi oligonucleotidic. Đặc hiệu phát hiện phụ thuộc vào mức độ tương đồng và bổ sung giữa mục tiêu và mồi và GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 27 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm nhiệt độ lai (hybridization temperature). Các vòng sao chép của PCR là kết quả trong một khuếch đại theo cấp số nhân của số lượng các chuỗi mục tiêu và làm tăng đáng kể khả năng phát hiện một chuỗi hiếm hoặc số tương đối thấp của các vi sinh vật mục tiêu trong một mẫu (Bej et al, 1990;.. Waage và cộng sự, 1999a , b;. Burtscher et al, 1999). Phương pháp PCRthường được áy dụng cho việc phát hiện và xác định các vi khuẩn bao gồm một sao chép vòng sau bước tách chiết DNA trong ống nghiệm (in vitro). Khuếch đại được thực hiện trên hàm lượng axit nucleic thu được bằng một ly giải tế bào theo sau là một chiết xuất hóa học. Các bước chiết táchcó thể được thực hiện trên màng lọc để giữ lại tế bào vi khuẩn(Bej và cộng sự, 1991a;. Juck và cộng sự, 1996;..Iqbal và cộng sự, năm 1997; Tsen et al., 1998). Quá trình khuếch đại PCR bao gồm: (i) một biến tính DNA từ mạch đôi- để DNA chuỗi đơn, (ii) mồi ủ với DNA sợi đơn ở nhiệt độ lai cụ thể, và (iii) mở rộng lót bởi một DNA polymerase Taq. Khuếch đại của một chuỗi bằng phương pháp PCR thường đòi hỏi 20 đến 40 chu kỳ. Sản phẩm PCR được phát hiện sau khi điện di trên gel agarose và sau khi nhuộm các sản phẩm khuếch đại bởi một loại thuốc nhuộm fluorochrome hoặc lai với một đầu dò được gắn nhãn. Phương pháp PCR thường được mô tả để phát hiện và xác định các vi sinh vật trong thực phẩm, đất, trầm tích và nước. Nếu chi tiết cols nguyên thủy cho việc sử dụng PCR trên ples thực sam- môi trường đã có sẵn trong nhiều năm (Trevors và van Elsas, 1995), áp dụng phương pháp này để xác định các vi sinh vật trong nước uống là gần đây. Một số thử nghiệm đã được phát triển để phát hiện các tổng coliform (total coliform) TC, coliform phân (faeacl coliform) FC (E. coli và vi sinh vật có liên quan) và tác nhân gây bệnh bao gồm cả vi khuẩn Salmonella spp. (Bảng 2). Đối với vi khuẩn, phát triển đoạn mồi đã gặp khó khăn kể từ khi nhóm coliform, theo quy định của ngành công nghiệp nước, là một nhóm đa dạng, bao gồm nhiều chi và loại trừ một số được liên kết chặt chẽ. Kết quả là, mồi phải đủ cụ thể mà họ không phát hiện chặt chẽ phylogenetically không liên quan đến vi khuẩn. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 28 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Mồi dựa trên gen lacZ đã được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn bởi vì phương pháp giám sát coliform thường được dựa trên các sản phẩm biểu thức (bgalactosidase) của gen này (Bej et al, 1990, 1991a, b;.Fricker và Fricker, 1994). Sản phẩm PCR của các kích cỡ khác nhau (326 và 264 bp) được tạo ra bằng cách sử dụng cặp mồi khác nhau và kết quả là phát hiện của TC với số lượng nhỏ như tế bào 1/100 ml sử dụng đầu dò gen đánh dấu phóng xạ (Bej et al., 1990, 1991a). Fricker và Fricker (1994) đã nghiên cứu đặc trưng của mồi cùng thiết lập như Bej et al. (1991a) trên 324 chủng trực khuẩn nuôi cấy. Họ kết luận rằng một bộ mồi nên được phát triển từ mức dựa vào gen lacZ không cho phép phân biệt đối xử của một số chủng odorifera Hafnia alvei và Serratia. Để phát hiện cụ thể của vi khuẩn E. coli, một vùng của gen malB này mã hóa một protein vận chuyển maltose là chuỗi mục tiêu đầu tiên đề xuất (Bej et al., 1990). Khu vực này bao gồm các gen mà thịt cừu mã hóa một protein bề mặt được công nhận bởi một E. coli- vi khuẩn cụ thể. Tuy nhiên, các thành viên của Shigella và Salmonella chi cũng có thể được phát hiện bằng cách sử dụng bộ mồi này. Việc sử dụng các gen uidA sau đó đã được đề xuất để phát hiện vi khuẩn E. coli (Bej et al., 1991a, b; Tsai và cộng sự., 1993). Cả hai khu vực quy định (uidR) và gen mã hóa các uidA dase BD-glucuroni- (GUD) enzyme được sử dụng sau đó có Một khu vực Amplified chi tiết: gen lacZ: mã hóa cho enzym b-galactosidase; gen cừu: mã hóa cho một protein bề mặt được công nhận cụ thể do vi khuẩn E. coli lambda; gen uidA: mã hóa cho enzym BD-glucuronidase; gen uidR: mã hóa cho khu vực quản lý của uidA; gen phoE: mã hóa cho một protein màng ngoài lỗ rỗng hình thành. Thành công (Fricker và Fricker, 1994;. Juck và cộng sự, 1996;.Iqbal và cộng sự, 1997). Các cặp mồi được cụ thể cho E. coli và Shigella spp. Bej et al. (1991b) đã báo cáo độ nhạy tốt hơn của phương pháp PCR so với các bài kiểm tra bề mặt được xác định dựa MUG-. Nhiều chủng E. coli MUG âm, trong đó bao gồm các E. coli GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 29 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm gây bệnh của type huyết thanh O157: H7, đã được phát hiện sau khi PCR cation amplifi- của gen uidA. Hơn nữa, Phong et al. (1991) đã chỉ ra rằng nhiều chủng MUG âm có gen uidA ngay cả khi sản phẩm gen (enzyme b-D-glucuronidase) không được thể hiện. Cặp mồi khác được thiết kế cho hai khu vực khác nhau đã được đề xuất để phát hiện vi khuẩn E. coli, một trong số họ mã hóa cho một protein bên ngoài màng (gen phoE) (Spierings et al., 1993) và một trình tự DNA mã hóa cho các vùng V3 và V6 của gen 16S rRNA của bệnh và chủng không gây bệnh của vi khuẩn E. coli (Tsen et al., 1998). Những cặp mồi cho phép phát hiện cụ thể của vi khuẩn E. coli, mà còn của các loài vi khuẩn Shigella khi các trình tự đề nghị được khuếch đại. Để tăng tính đặc hiệu của việc phát hiện bằng phương pháp PCR, một số tác giả đã đề xuất việc sử dụng các phản ứng multiplex PCR, trong đó bao gồm đồng thời khuếch đại đoạn DNA khác nhau. Bej et al. (1991b) sửa đổi phương pháp này để phát hiện các trình tự gen liên quan đến nhóm TC và những người liên quan đến tác nhân gây bệnh đường ruột như E. coli, Salmonella spp. và Shigella spp. Multiplex PCR có thể không hoạt động tốt với tất cả các hỗn hợp mồi, tuy nhiên. Thành phần và chiều dài của pri- mer oligonucleotide, cũng như kích thước của các mảnh vỡ AMPLI-fied, có thể ảnh hưởng lẫn khuếch đại PCR. Ví dụ, khuếch đại multiplex của TC và E. coli được thực hiện bằng nồng độ cân bằng các mồi cả, trong khi nồng độ mồi đẳng phân tử không cần thiết cho việc phát hiện đồng thời Legion- viêm phổi Ella và tất cả các vi khuẩn thuộc chi (Bej et al., 1991a). Để phát hiện các mức thấp của tác nhân gây bệnh hoặc vi sinh vật chỉ thị trong các mẫu nước, một bước tập trung như lọc trước tiên phải được thực hiện. Bej et al. (1991a) báo cáo sử dụng phương pháp lọc và phát hành bởi DNA đóng băng tan băng đi xe đạp mà không ảnh hưởng đến sự khuếch đại PCR. Khi trực quan của sản phẩm PCR được thực hiện bằng cách sử dụng lai tạo với các đầu dò phóng xạ, phương pháp này cho phép một giới hạn phát hiện lên đến 1 tế bào / 100 ml. Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp này để theo dõi thường xuyên có thể là khó vì trực quan của sản phẩm bởi hóa hybrid- với một đầu dò phóng xạ có thể yêu cầu 2-3 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 30 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm ngày kể từ khi phơi nhiễm. Hệ thống phát hiện không phóng xạ, giống như mồi biotinylated, có thể là một thay thế hữu ích cho nhiều phát hiện nhanh chóng của DNA mục tiêu thăm dò lai. Juck et al. (1996) đã phát triển một giao thức để phát hiện nhanh chóng nồng độ thấp của E. coli trong các mẫu nước dựa trên giao thức PCR lồng nhau và sự thay đổi của giao thức lọc bằng Bej et al. (1991a). Nested PCR bao gồm hai vòng utive consec- khuếch đại PCR. Việc chạy đầu tiên được thực hiện như bình thường, với mồi ủ với các khu vực mục tiêu cụ thể (mẫu) tiếp theo là phần mở rộng cho sion mồi. Vòng thứ hai sử dụng các sản phẩm của sự khuếch đại đầu tiên làm mẫu cho một vòng của ủ và mở rộng với sơn lót khác nhau Người ta thường liên minh sản phẩm của các kết quả khuếch đại thứ hai trong một mảnh đó là nội bộ để sản phẩm của vòng đầu tiên của khuếch đại PCR. Nested PCR tăng hiệu quả khuếch đại từ các cấp địa phương phát hiện sản phẩm PCR tạo ra trong vòng đầu tiên được khuếch đại để đạt được mức độ phát hiện ở vòng thứ hai.Việc sử dụng các đoạn mồi lồng nhau cung cấp một cấp độ quốc Ngoaøi tính cụ thể kể từ vòng PCR thứ hai chỉ có thể được thực hiện nếu đúng trình tự (plementary đồng để mồi bên trong) được khuếch đại trong vòng đầu tiên. Giao thức Nested PCR được sử dụng để phát hiện vi khuẩn E. coli (Juck et al, 1996.) Và một số tác nhân gây bệnh (Delabre et al, 1997.)Trong nước uống, trong khi Waage et al. (1999a, b) áp dụng chúng vào việc phát hiện số lượng thấp của Salmonella spp. và Y. enterocolitica tế bào ở vùng biển.Kỹ thuật này cho phép phát hiện một nhanh hơn (6-8 h) so với PCR thông thường (vài ngày), kể từ khi xác nhận của chuỗi khuếch đại chính xác bằng đầu dò lai là không còn cần thiết. Mặc dù độ nhạy cảm của mình, rất khó để sử dụng PCR để xác định số lượng vi sinh vật. Hai kỹ thuật chủ yếu được phát triển cho DNA định lượng bằng phương pháp PCR: (. Toranzos et al, 1993) các đại nhất có thể xảy ra, số lượng PCR và PCR cạnh tranh (thêm một đối thủ cạnh tranh cho giai đoạn DNA PCR để hiệu chỉnh hiệu quả PCR) (Zachar et al., 1993).Để kiến thức của chúng tôi, các kỹ thuật này chưa được áp dụng từ trước đến nay cho các định lượng coliform trong nước uống.Như vậy, hiện nay, nó dường như không thể định lượng mật độ coliform trong nước uống bằng phương pháp GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 31 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm PCR.Cho đến nay, MPN-PCR vẫn không chính xác và PCR cạnh tranh đòi hỏi sự prepara- đáng kể trước đối thủ cạnh tranh DNA tốt được áp dụng cho các mẫu nước. Một cách tiếp cận đầy hứa hẹn là thời gian thực tích định lượng PCR, trong đó bao gồm giám sát các sản phẩm fluores- cently PCR khi chúng được khuếch đại (Heid et al., 1996). Động học của sản phẩm PCR là một giai đoạn tích lũy theo cấp số nhân theo sau là một giai đoạn cao nguyên. Sự xuất hiện của cao nguyên này phụ thuộc vào nhiều thông số soát không kiểm soát, chẳng hạn như dimerization mồi và sự xuất hiện của các chất ức chế. Cation thời gian thực quantifi- là đáng tin cậy hơn so với điểm cuối xác định số lượng vì các phép đo được thực hiện trong giai đoạn theo cấp số nhân. Nó cũng có thể phát hiện các vấn đề ition inhib- của phản ứng PCR do các chất ức chế đồng tinh khiết với DNA. Cách tiếp cận này gần đây đã được áp dụng cho việc phát hiện và enterohemorhagic enterotoxigenic E. coli chủng vi sinh lâm sàng (Bellin et al, 2001;. Carroll và cộng sự, 2001.). Khi sản phẩm PCR khuếch đại được nhuộm với thuốc nhuộm SYBR Green, sử dụng một LightCycler (Roche, Mannheim, Ger- nhiều) hoặc một GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, Mỹ), phương pháp PCR thời gian thực hiện nhanh chóng hơn và độ nhạy cao hơn và độ đặc hiệu trong sự so sánh với các xét nghiệm PCR song với phân tích gel truyền thống (Carroll et al., 2001). Tuy nhiên, phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi để phát hiện cụ thể của vi sinh vật hiện nay nồng độ thấp trong các mẫu môi trường, nhưng có thể được phát triển trong tương lai. Gần đây hơn, Tani et al. (1998) đã đề xuất một điều tra trực tiếp các tế bào mục tiêu bằng cách sử dụng trực tiếp trong xét nghiệm PCR tại chỗ. Sự khuếch đại của một trình tự cụ thể được thực hiện từ một gen đơn bản sao hiện diện trong các tế bào. Các giao thức PCR thông thường phải được sửa đổi để trình tự axit nucleic có thể được khuếch đại trong cơ thể. Với cố định và permeabilization những điều kiện thích hợp, mồi oligonucleotide và các thành phần phản ứng khác có thể khuếch tán vào các tế bào, và khi đi xe đạp nhiệt, khuếch đại trình tự mục tiêu cụ thể. Sản phẩm PCR được dán nhãn bởi digoxigenin-UTP (DIG- dUTP), và các mảnh vỡ chống DIG Fab 'liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 32 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm quang epifluores-. Cách tiếp cận này cho phép nhìn thấy trực tiếp các sản phẩm khuếch đại huỳnh quang ở một mức độ đơn bào và do đó một điều tra trực tiếp có thể được dán nhãn của các tế bào. Các tác giả đã áp dụng phương pháp PCR mới này với sự enumera- trực tiếp của E. coli từ mẫu nước ngọt.Kết quả cho thấy một tín hiệu cường độ huỳnh quang yếu của các tế bào mục tiêu.Tuy nhiên, họ kết luận rằng phân tích hình ảnh cho phép một điều tra trực tiếp các tế bào mục tiêu E. coli. Mặc dù trong giao thức PCR chỗ dường như ing promis-, nó đã không được sử dụng cho việc phát hiện thường xuyên và đếm số vi sinh vật trong nước. Nhiều hạn chế liên quan đến các đặc điểm kỹ AMPLI-PCR của DNA cần phải được giải quyết trước khi phương pháp này có thể được sử dụng để phân tích nhạy cảm của vi khuẩn trong mẫu nước uống. Mặc dù phương pháp này đã được sử dụng với một số thành công để phát hiện E.coli và coliforms, cần phải chỉ ra rằng hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trên mẫu nước tăng vọt với các chủng nuôi cấy vi khuẩn (Bảng 2) và xác nhận là hiếm khi, hoặc không, được thực hiện trên các mẫu môi trường. Mặc dù thực tế là PCR được công nhận là một phát hiện và xác định phương pháp rất cụ thể, nó có thể trình bày một số hạn chế khi áp dụng cho việc phát hiện các tế bào trong một mẫu tự nhiên là khả thi hoặc trao đổi chất hoạt động mà không bị culturable. Thật vậy, khuếch đại PCR áp dụng đối với acid nucleic chiết xuất từ tế bào sống và culturable, khả thi và không culturable hay đã chết. Do đó, xét nghiệm PCR không thể cung cấp thông tin về tình trạng sinh lý của tế bào mục tiêu. Một hạn chế cố hữu để phân tích PCR các mẫu môi trường là ức chế thường xuyên của các phản ứng enzym: Các chất humic được gọi là (ASE Taqpolymer-) enzyme trùng hợp chất ức chế, và chất keo có ái lực cao với DNA (Way và cộng sự, 1993. ). Sự hiện diện của các yếu tố này trong một mẫu nước do đó có thể đáng kể giảm năng suất khuếch đại PCR được áp dụng để phát hiện các vi khuẩn pha loãng rất nhiều. Họ cũng có thể hạn chế việc tiết lộ các sản phẩm khuếch đại (Straub et al., 1995). GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 33 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 5.2.2. Kỹ thuật lai in situ (In situ hybridization techniques) ISH sử dụng đầu dò oligonucleotide để phát hiệnchuỗi axit nucleic bổsung. Phương pháp này khai thác khả năng của axit nucleic để bám với nhau một cách bổ sung rất cụ thể để tạo giống lai. Các đầu dò được cụ thể bởi vì chúng được xây dựng từ, và được bổ sung vào, chọn nucleic acid chuỗi đó là duy nhất để đưa ra một vi sinh vật, các loài hoặc nhóm. Các đầu dò có thể nhắm mục tiêu hoặc là ADN hoặc các phân tử RNA. Sử dụng trình tự rRNA (5S, 16S và 23S) để nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài trên cơ sở của sự phân kỳ của họ và để phát triển thiết bị thăm dò lai rất quyết tâm, bây giờ cũng được thành lập (Amann et al, 1995.). Trình tự của hơn 2500 của rRNA 16S loài vi khuẩn hiện trao các gen có giá trị thông tin rất cao ở một mức độ phát sinh loài. So sánh trình tự làm cho nó có thể để xác định các khu vực mục tiêu được bảo tồn hoàn hảo trong mức độ phân loại khác nhau và do đó cụ thể để các cấp, từ các tên miền để phân loài. Cũng quan tâm trong mục tiêu phân tử rRNA là mức cao của các phân tử rRNA bản, đó là lần lượt liên kết với số lượng lớn các ribosome trong tế bào. Số lượng ribosome khác nhau, thường từ 103 đến 105 trên vi khuẩn, theo các loài và trạng thái logic physio- của các tế bào, và được trực tiếp tương quan với tốc độ tăng trưởng của tế bào (Amann et al., 1995). Đầu dòcụ thể để rRNA (chủ yếu là 16S và 23S rRNA CES tuần tự) đã trở thành công cụ tiêu chuẩn để xác định sinh vật (Olsen và cộng sự, 1986.). Một số thiết bị thăm dò oligonucleotide thương mại hóa và lựa chọn xem có nên sử dụng chúng hay thiết kế, những người cụ thể mới phụ thuộc phần lớn vào ứng dụng. Để tìm chuỗi mục tiêu liên tục duy nhất cho một vi sinh vật cụ thể, các nhà nghiên cứu dựa vào máy tính hỗ trợ so sánh trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu dự án ribosome (RDP) (Maidak et al., 1996), trong GenBank cho DNA (Benson et al., 1999), hoặc trong gói phần mềm ARB (Viện Max Planck, Bremen, Đức). Đối với đặc trưng tốt hơn, trình tự mục tiêu nên ngắn (15 đến 30 base) và có ít nhất 2-3 nucleotide khác nhau với chuỗi của các sinh vật liên quan chặt chẽ (DeLong, 1993) Làm việc sớm trong chỗ lai dựa vào thăm dò phóng xạ để phát hiện và phát hiện các mục tiêu lai probe- (Olsen và cộng sự, 1986.). Công việc hiện tại trên rRNA trong GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 34 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm lai tại chỗ huỳnh quang sử dụng đầu dò nucleotide nhãn hầu như chỉ để phát hiện hóa hybrid- (FISH). Sự phổ biến của kỹ thuật FISH là do lợi thế của mình đối với nhãn phóng xạ, trong đó bao gồm độ nhạy, tốc độ của trực quan của tế bào đơn (bằng kính hiển vi hoặc các thiết bị cytometrical), sự ổn định của sản phẩm lai, an toàn, thời gian phát hiện giảm đi, nhiều nhãn (nhiều màu sắc) và dễ sử dụng (Richardson et al., 1991; DeLong, năm 1993; Swinger và Tucker, 1996). Huỳnh quang và thuốc nhuộm Rhodamine là fluorochromes xuyên sử dụng độ thường xuyên nhất (DeLong và cộng sự năm 1989,;. Amann và cs, 1990;. Manz và cộng sự, 1992;. Năm 1993;. Wagner và cộng sự, 1994), nhưng thuốc nhuộm CY3, sáng hơn và dẫn đến giảm huỳnh quang không đặc hiệu hơn so với rochromes fluo- khác, gần đây đã thu hút được sự chú ý nhiều hơn (Wessendorf và Brelje năm 1992; Glockner và cộng sự năm 1996,;. Zarda et al, 1997;. Kalmbach và cộng sự 1997a,;. Ouverney và Fuhrman, 1999). Trong thực tế, các bước thủ tục cá là: cố định tế bào, lai (đặc và nghiêm ngặt phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian lai, nồng độ muối, nồng độ thăm dò và chiều dài), rửa hậu lai (để loại bỏ ràng buộc hoặc không cụ thể tài liệu ràng buộc) và phát hiện. Tế bào lai này thường được phát hiện bằng kính hiển vi và một epifluorescence counterstain như vậy như DAPI (40,60-diamidino-2-phenylindole) hoặc màu cam acridine được sử dụng để xác định tổng số tế bào. Tùy thuộc vào nồng độ của các tế bào mục tiêu trong mẫu và để tăng độ phân giải, phát hiện cá có thể được thực hiện bằng các phương tiện lưu lượng hoặc pha rắn đếm tế bào. Đo dòng tế bào cho phép định lượng cường độ huỳnh quang cho mỗi mục tiêu thăm dò lai (Fuchs và cộng sự, 1998.). Đối với TC, sự phát triển của một cụ thể 16S rRNA thăm dò cho nhóm này là không thể, kể từ khi nhóm coliform theo quy định của ngành công nghiệp nước là một nhóm có chứa vi khuẩn từ chi được phylogeneti- Cally khác nhau. Kết quả là, các đầu dò (Bảng 3) đã được phát triển cho họ Enterobacteriaceae hơn là cho TC. Việc đầu tiên, Entero (Mittelman et al., 1997) đã được phát triển để phát hiện lâm sàng của nhiễm trùng đường tiểu. Thứ hai, ENT1 (Loge et al., 1999) đã được phát triển cho các ứng dụng trên các mẫu nước thải. Hai mẫu dò khác nhau trong thành GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 35 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm phần của họ và trong các điều kiện lai. Các Entero thăm dò là dài 25 base có hàm lượng C + G 48% so với 17 cơ sở và 70% C + G cho đầu dò ENT1. Nghiên cứu trong RDP (Maidak et al., 1996) cho thấy tính đặc hiệu cao đối với đầu dò ENT1 cho các loài Enterobacteriaceae hơn so với thăm dò Entero (Rompre' và Baudart, NSERC Chủ tịch công nghiệp vào nước uống, Ecole Polytechnique Montreal,thong tin cá nhân). Trình tự rRNA thăm dò mục tiêu để phát hiện vi khuẩn E. coli cũng đã được công bố. Các đầu dò EC1531 (Poulsen et al., 1994), bổ sung cho một chuỗi 23S rRNA, bao gồm 20 nucleotide với nội dung C + G 55%. Shi et al. (1999) đã sử dụng đầu dò này để phát hiện vi khuẩn E. coli sau khi thay đổi các điều kiện lai, nhưng không có kết quả đã đề cập. Các đầu dò đã được sử dụng như một điều khiển trong một thí nghiệm bằng cách sử dụng một mô hình thu nhỏ chiết xuất tăng vọt với E. coli DNA. Gần đây hơn, Regnault et al. (2000) đã phát triển thăm dò Colinsitu để phát hiện vi khuẩn E. coli và E. fergusonii trong nước tiểu, nước (sông và nước thải) và các mẫu thực phẩm. Các đồng Colinsitu thăm dò mang đến những bổ một chuỗi 16S rRNA và bao gồm 24 nucleotide (C + G nội dung của 46%). thăm dò này cho thấy độ đặc hiệu tốt cho trực quan của E. coli từ các phương tiện truyền thông khác nhau đã được thử nghiệm và mới được sử dụng thành công để phát hiện vi khuẩn E. coli trong nước uống mẫu (Delabre et al., 2001). Kỹ thuật FISH dường như là một phương pháp phát hiện rất cụ thể ở cấp độ tế bào; Tuy nhiên, nó có thể có một số hạn chế khi áp dụng cho việc phát hiện các chất dinh dưỡng bị bỏ đói các tế bào vi khuẩn phổ biến trong drink- bảng 3 Đầu dò oligonucleotide được sử dụng để xác định các Enterobacteriaceae và E. coli trong môi trường Thăm dò liên tục (50 -30) rRNA vị trí mục tiêu đặc tài liệu tham khảo  ENTEROa CATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCC 16S, 1458-1482 Enterobacteriaceae Mittelman et al, 1997. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 36 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm  ENT1 CCGCTTGCTCTCGCGAG 16S, 1273-1289 Enterobacteriaceae Loge et al, 1999.  EC1531 CACCGTAGTGCTCGTCATCA 23S, 1531 -. 1550 E. coli Poulsen et al, 1994  COLINSINTU GAGACTCAAGATTGCCAGTATCAG 16S, 637-660 E. coli Regnault et al, 2000.  PNA thăm dò GCAAAGCAGCAAGCTC 16S, 71-86 E. coli Prescott và Fricker, 1999 Ở đây Entero cho sự khác biệt dễ dàng hơn vì không có tên đã được đưa ra bởi các tác giả trong nước. Những hạn chế này có liên quan đến một nội dung ribosom của vi khuẩn nhỏ và do đó số lượng nhỏ các 16S rRNA mục tiêu của các tế bào, trong đó gây ra tín hiệu lai huỳnh quang yếu (Amann et al, 1995;. Lebaron et al, 1997.). Đây có lẽ là lý do tại sao cá hiếm khi được mô tả trong các tài liệu nước uống vào lúc này. Kết quả là, hệ thống khuếch đại rescence fluo-, chẳng hạn như nhiều thăm dò (thay vì monolabeled thăm dò trong kỹ thuật FISH ventional dựng), tính tương tác của các biotine - avidine phức tạp và / hoặc cải ngựa trăm oxydase liên hợp với fluorochrome - tyramide- nền , có thể đại diện cho một cách để tăng cường độ của tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi các tế bào lai đói (Lebaron et al, 1997;. scho nhuber et al, 1997.). Gần đây, Prescott và Fricker (1999) báo cáo việc sử dụng một axit nucleic peptide (PNA) thăm dò cho lai tạo tại chỗ và phát hiện các vi khuẩn E. coli trong nước máy. Các kết quả lai cũng tương tự như những người thu được từ phương pháp đếm tấm. Một PNA là một axit nucleic tổng hợp, trong đó xương sống đường được thay thế bằng một xương sống peptide. Những lợi thế để sử dụng PNA thay vì đầu dò DNA bao gồm kháng tốt hơn để nuclease tấn công, hybrid- hóa độc lập với nồng độ muối, nhiều biệt ràng buộc cific và trình tự thăm dò ngắn hơn, để đạt được độ nhạy lớn hơn. Kể từ khi thăm dò PNA liên kết mạnh mẽ hơn với các trang web mục tiêu, phản ứng lai có thể được hoàn thành trong một thời gian ngắn (30 phút). Theo hiểu biết của chúng tôi, ngoại trừ tàu thăm dò E. coli GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 37 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm PNA (Prescott và Fricker, 1999), không ai trong số những thiết bị thăm dò đã được sử dụng cho vi khuẩn hoặc vi khuẩn gây bệnh giám sát trong nước uống. Trước khi họ được chấp nhận như một phương pháp điều tra coliform nhạy cảm, họ phải đầu tiên phải chịu một giai đoạn xác nhận để thăm dò phù hợp nhất cho các mẫu phân tích có thể được lựa chọn và để tối ưu hóa các điều kiện lai nếu cần thiết. Khả năng di động là một câu hỏi lớn nảy sinh trong việc sử dụng cá để theo dõi ô nhiễm nguồn nước uống. Nó được thành lập rằng nội dung rRNA của các tế bào vi khuẩn có tương quan trực tiếp với tốc độ tăng trưởng (Amann et al., 1995). Tuy nhiên, nội dung rRNA của một loại vi khuẩn có thể không hoàn toàn phản ánh tình trạng sinh lý của nó. Có vẻ như một số lượng nhỏ các phân tử rRNA có thể duy trì trong một thời gian tương đối dài sau khi mất culturability. S. aureus và E. coli rRNA vẫn còn phát hiện 48 giờ sau khi kích hoạt vừa phải nhiệt hoặc tia UV (McKillip et al., 1998). Sheridan et al. (1998) vẫn còn tìm thấy vi khuẩn E. coli 16S rRNA 16 giờ sau khi ngừng hoạt động nhiệt ở mức 100, 80 và 60 C. Cuối cùng, Prescott và Fricker (1999) tiếp xúc với một chủng E. coli đến 1,5 mg / l clo cho đến 30 phút. Sử dụng đầu dò PNA và tyramide huỳnh quang hệ thống cation amplifi(TSA bộ; Perkin Elmer Khoa học đời sống, Ontario, Canada), họ vi khuẩn vẫn phát hiện ngay sự sau khi khử trùng bằng clo, trong khi không có các tế bào được phát hiện bởi số lượng đĩa hoặc các phương pháp Colilert. Hai tuần sau khi khử trùng bằng clo, 10% các tế bào vẫn bị phát hiện bởi bộ PNA thăm dò-TSA. Điều này có thể được xem như là một lợi thế cho các phương pháp trong đó các hình thức colikhông culturable có thể được phát hiện, hoặc là một bất lợi trong đó các tế bào chết có thể được liệt kê. Nghiên cứu sâu hơn về tình trạng sinh lý của vi khuẩn được liệt kê bởi cá vẫn còn cần thiết để đi đến một kết luận về câu hỏi này. Một cách có thể để nghiên cứu vấn đề này là vài kỹ thuật số khả thi trực tiếp (DVC) (Kog- ure et al., 1979) với phát hiện FISH (Nishimura et al., năm 1993; Kalmbach et al., 1997b). Khớp nối này gần đây đã được áp dụng để phát hiện vi khuẩn E. coli trong nước uống của Delabre et al. (2001). Các tác giả thấy đáng kể cao hơn E. coli phong phú với giao thức của họ hơn bởi số lượng tấm. CÁ hiện đang được coi là một phương GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 38 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm pháp phát hiện tế bào đặc hiệu cao, và là tương đối dễ dàng để thực hiện. Các đặc trưng của phát hiện phụ thuộc vào đặc trưng của tàu thăm dò oligonucleotidic và tính chặt chẽ các điều kiện sử dụng lai. Cation Identifi- của chuỗi mục tiêu vẫn còn tẻ nhạt, tuy nhiên, cá không thể được áp dụng để phát hiện các phi phylogenetically xác định vi sinh vật, chẳng hạn như vi khuẩn. Trong trường hợp này, công việc có thể được thực hiện trên nghieäp obacteriaceae, các phylogenetically xác định nhóm gần nhất mà có thể được coi là một chỉ số tiềm năng của ô nhiễm phân. 6. Kết Luận Mục đích của bài viết này là: - Để truyền đạt inventory và gần đây hơn là phương pháp phát hiện nhóm coliforms, chủ yếu là những áp dụng cho phân tích chất lượng vi sinh - Để đánh giá những hạn chế của phương pháp này về độ nhạy và ứng dụng của nó Ngày nay kỹ thuật màng lọc là một phương pháp phổ biến nhất cho việc đếm coliforms trong nước uống , kỹ thuật này đơn giản, dễ thực hiện và không tốn kém, đòi hỏi phải có thời gian ủ ít nhất là qua đêm ( 24-72 giờ hơn) sau khi điều tra khuẩn lạc ban đầu, Hơn nữa, khi tiêu chuẩn media môi trường thạch được sử dụng với kỹ thuật này là ức chế, coliforms yếu hoặc bị tổn thương phát triển trong môi trường đặc biệt như( m-T7) và việc bổ sung các hợp chất cụ thể ( như pyruvate) nâng cao tỷ lệ phục hồi của các tế bào yếu hoặc bị tổn thương, Ngoài ra, thời gian thực hiện dài, độ dài của nó phụ thuộc vào các thử nghiệm sinh hóa sử dụng cho các bước xác nhận, vẫn còn yếu tố hạn chế Những thách thức quan trọng đối với sự phát triển của phương pháp phát hiện coliforms mới là để cải thiện các đặc tính của phương pháp này, mà có thể loại bỏ làm tốn thời gian, để đưa vào các tế bào yếu hoặc bị tổn thương và để giảm thời gian phân tích GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 39 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Một cuộc điều tra hoạt động của enzyme cụ thể nên được cải thiện độ nhạy của việc phát hiện EColi, sử dụng -D galactosidase và -Dglucuronidase, Nhiều chất chromgenic và chất huỳnh quang tồn tại cho việc phát hiện hoạt động của enyme và thử nghiệm trên cơ sở các chất nền có sẵn, Rất nhiều so sánh giữa thử nghiệm này và các phương pháp tiêu chuẩn đã chỉ ra rằng nó có thể là lựa chọn phù hợp với kỹ thuật MF, Các bài kiểm tra dễ dàng thực hiện, chỉ yêu cầu thiết bị, phòng thí nghiệm cơ bản, hiển thị độ nhạy và độ đặc hiệu cao, Tuy nhiên phương pháp này đắc hơn, thậm chí nhiều hơn như vậy nếu thời gian ủ giảm (khoảng 18h ) và mất quá lâu để có kết quả trong ngày Phát hiện coliforms bằng phương pháp tiếp cận tìm hiểu enzyme ở mức độ tế bào kết hợp với các đầu dò huỳnh quang cũng có thể được đề xuất, các phương pháp này cho phép phát hiện rất cụ thể và nhanh chóng mà không cần một bước nuôi cấy nào, thời gian thực phương pháp phát hiện được phát triển bởi Van Poucke và Nelis ( 2000a,b),Phương pháp tiếp cận mới này cho phép tăng độ nhạy trong khi nhanh hơn so với thử nghiệm khác Phương pháp miễn dịch, phương pháp này đã rất phổ biến, dễ dàng áp dụng nhưng vẫn còn một số hạn chế lien quan đến phản ứng chéo của các tế bào không mục tiêu của kháng thể, Phương pháp PCR cung cấp một phát hiện ở mức độ đặc hiệu cao hơn, Neverless, phương pháp này có hạn chế lớn khi áp dụng cho các mẫu tự nhiên, bao gồm tỷ lệ khuếch đại thấp, liên quan đến sự hiện diện của các chất ức chế và thiếu thông tin về hoạt động sinh lý của tế bào. Phương pháp PCR yêu cầu đội ngủ nhân viên có tay nghề cao cũng như không gian phòng thí nghiệm chuyên dụng và thuốc thử cụ thể để tránh nhiểm bẩn của các mẫu AND bên ngoài, đặc biệt là khi nested-PCR yêu cầu. Phương pháp FISH cũng cần được xem xét như là 1 phương pháp đếm thay thế cho việc điều tra coliforms trong nước uống, như phương pháp này cũng chỉ hiện định lượng trong vòng 1 ngày. Hiện nay việc sử dụng các thiết bị thăm dò oligomicnucleonde cho việc đếm coliform là không phổ biến. Các vấn đề lớn với GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 40 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm việc áp dụng FISH để đếm các tế bào có chỉ số phân trong mẫu nước uông lien quan đến tình trạng sinh lí của vi khuẩn nước uông (do chất khử trùng). Trên thực tế những tế bào vi khuẩn thường được đặc trưng bởi hàm lượng sibosome nhỏ, làm phức tạp việc phân tích của positne fluoucseent signals. Việc sử dụng các đầu dò PNA thay DNA hoặc sử dụng các hệ thấy khuếch đại huỳnh quang nên cường độ nhạy cao và cường độ huỳnh quang của positive signdes. Việc áp dụng FISH trong mẫu nước uống hiện nay đòi hỏi phải phát triển cao hơn nữa để đạt được việc đếm tối ưu các tế bào thiếu dinh dưỡng yếu đi. Thường coliforms được tìm thấy với số lượng nhỏ trong mẫu nước uống do đó việc điều tra ở cấp độ tế bào của tế bào mục tiêu lien quan đến việc lựa chọn. Mới đây Joux and Lebara (2000) phân tích những hạn chế về số lượng và chất lượng của công cụ phân tích huỳnh quang khác nhau (kính hiển vi huỳnh quang, flow cytometer, confocal scanning laser microscope and the new solid –phase laser scanning cytometer), Sự xuất hiện các phát hiện và thời gian thực của các phương pháp mới có lien quang đến sự cần thiết cho các chuẩn đoán đánh giá tốt hơn về chất lượng vi sinh của nước, Mục tiêu này có thể đạt được thong qua sự gia tăng trong việc phát hiện cụ thể và giảm thời gian phân tích Tuy nhiên kỹ thuật phức tạp và chi phí tương ứng cao hạn chế của mình để trở thành phương pháp chuẩn hóa cho việc phát hiện coliforms trong mẫu nước uống. Hơn nữa , với kiến thức hiện có trong công việc hiện tại ngoại trừ Delabre et al(2001) nghiên cứu, vẫn chưa chứng minh được rằng một tỷ lệ đáng kể các chỉ thị tế bào đựợc tìm thấy trong một trạng thái khả thi hoặc hoạt động nhưng không culturable trong hệ thống phân phối, Nếu đây là một trường hợp, các bước nghiên cứu tiếp theo sẽ là đánh giá khả năng tác động của các tế bào sống hoặc hoạt động nhưng không chỉ về khả năng gây bệnh, mà còn về khả năng tái sinh GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 41 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm LỜI CẢM ƠN Đánh giá này là một phần của dự án nghiên cứu một cách tiếp cận toàn diện để kiểm soát toàn bộ coliforms trong hệ thống phân phối nước uống được hỗ trợ bởi Vivendi Water-US-Filter, Tác giả cám ơn tiến sĩ Camper và Dr.V.Gautheir cho những rà soát hữu ích của họ trong bản thảo. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 42