Bài giảng: HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM.doc (sinh học thực phẩm)

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bài giảng: HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM (Dùng cho sinh viên hệ cao đẳngvà đại học) TP.Hồ Chí Minh Tháng 2/2013 CHƯƠNG 1. ENZYME 1.1. Đại cương về enzyme Để sống và phát triển, cơ thể sinh vật phải thường xuyên trao đổi chất và trao đổi năng lượng với môi trường bên ngoài. Các quá trình này tiến hành được là nhờ các phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể theo quy luật có tổ chức và có liên quan chặt chẽ với nhau. Đặc điểm chung của các phản ứng này là có thể xảy ra một cách đặc hiệu, dễ dàng với vận tốc lớn ở ngay trong điều kiện môi trường sinh lý và nhiệt độ của cơ thể. Sở dĩ các phản ứng tiến hành trong cơ thể có những đặc điểm trên chính là nhờ các chất xúc tác đặc biệt có khả năng làm tăng vận tốc phản ứng lên gấp bội, đó là các chất xúc tác sinh học. Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể sinh vật. Enzyme tồn tại trong tất cả các tế bào sống của động vật, thực vật, vi sinh vật. Các phản ứng do enzyme xúc tác có thể xảy ra ở ngay trong cơ thể sống hoặc ở ngoài cơ thể. Hiện nay, đã tách được rất nhiều enzyme khác nhau từ nguồn động vật, thực vật, đặc biệt là từ vi sinh vật, trong đó có nhiều loại đã được thu nhận với độ thuần khiết cao. Xúc tác enzyme có nhiều ưu điểm hơn hẳn xúc tác thông thường như cường lực xúc tác lớn, tính đặc hiệu cao, không độc, có thể tác dụng trong điều kiện nhẹ nhàng, đơn giản. Hơn nữa có thể sản xuất enzyme từ các nguyên liệu giá rẻ nhưng đem lại hiệu quả kinh tế cao, nhờ vậy việc ứng dụng enzyme rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y học và nghiên cứu khoa học đã nhanh chóng có những bước tiến dài và ngày càng có nhiều triển vọng tốt đẹp. 1.1.1. Khái niệm enzyme Tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức là năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được trên mức năng lượng bình thường của chúng để cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa các phản ứng nào đó càng lớn thì tốc độ phản ứng càng chậm và ngược lại. Việc đưa một số chất nào đó vào trong hệ thống vốn có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học được gọi là sự xúc tác. Trong quá trình xúc tác, các chất xúc tác đã làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học. Năng lượng cần để xảy ra sự va chạm có hiệu lực dẫn đến phản ứng hóa học được gọi là năng lượng hoạt hóa. Trong quá trình xúc tác, các chất xúc tác chỉ tham gia vào các phản ứng trung gian sau đó chúng lại được phục hồi nhanh chóng, chất xúc tác không đóng vai trò như những chất tham gia phản ứng. Tốc độ các phản ứng thuận nghịch cũng được các chất xúc tác làm tăng theo cả hai chiều. Điều đó nói lên rằng: chất xúc tác không quyết định chiều hướng của phản ứng, chúng chỉ thúc đẩy cho phản ứng đạt đến cân bằng một cách nhanh chóng. Những luận cứ sau đây đã chứng minh bản chất xúc tác của enzyme: a) Cũng như các chất xúc tác nói chung, enzyme làm tăng nhanh tốc độ phản ứng. Enzyme không quyết định chiều hướng của phản ứng. b) Enzyme không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng trong phương trình phản ứng. Trong quá trình xúc tác, lượng enzyme không thay đổi. c) Cũng như mọi chất xúc tác khác, enzyme làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết của các phản ứng hóa học. Nói cách khác năng lượng hoạt hóa phản ứng được giảm đi nhiều khi có sự xúc tác của enzyme. 1.1.2. Cấu tạo phân tử enzyme 1.1.2.1. Enzyme là những chất xúc tác có bản chất protein. Trong sự phát triển của hóa sinh học, bước nhảy vọt đã đạt được khi người ta thực hiện thành công việc tách rút các chất xúc tác sinh học ra khỏi tế bào và nghiên cứu tính chất của chúng, lúc đó người ta nhận biết rằng enzyme có bản chất protein. Năm 1926, Sumner là người đầu tiên thu được urease ở dạng kết tinh. Cho đến nay đã có khoảng hơn 150 enzyme được rút ra ở dạng tinh khiết. Trong số các enzyme đó, một số đã được biết trọn vẹn về cấu trúc bậc I như ribonuclease, trypsin, chymotrypsin, … Ngày nay người ta xác nhận rằng, các enzyme chính là nhóm protein quan trọng. Chúng được hình thành trong tế bào như các proteinđơn giản (enzyme một thành phần) hoặc như các protein phức tạp (enzyme hai thành phần). Trong số các enzyme thì đa số là enzyme hai thành phần. Dạng hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm phần protein và phần không có bản chất protein gọi là nhóm prostetic (nhóm ngoại, nhóm ghép, …) Enzyme một thành phần là các protein đơn giản thực hiện chức năng xúc tác. Ví dụ: Ribonuclease A và một số enzyme thủy phân protein và một số enzyme khác. 1.1.2.2. Các nhóm ghép, các coenzyme Bên cạnh phần protein thì enzyme hai thành phần còn chứa phần không có bản chất protein. Người ta gọi phần không phải protein cần thiết bắt buộc đối với hoạt động của enzyme là nhóm ghép (nhóm ngoại, nhóm thêm, yếu tố phụ, …) và phần protein vốn liên kết với nhóm đó là apoenzyme, phức hợp của hai thành phần trên là holoenzyme (enzyme hai thành phần). Trong trường hợp nhóm ghép là những chất hữu cơ có trọng lượng phân tử bé được liên kết với phần protein thì nhóm ghép được gọi là coenzyme. Theo cách đó thì: Apoenzyme + Coenzyme Holoenzyme Nếu đứng riêng rẽ thì cả coenzyme cũng như apoenzyme đều không có khả năng xúc tác. Chỉ có lúc nào 2 phần này kết hợp với nhau thì hoạt tính xúc tác của enzyme mới thể hiện. Bản chất hóa học của coenzyme rất khác nhau: - Một số loại này chính là các vitamin. Sự liên quan về chức năng giữa các vitamin và các coenzyme được giới thiệu ở bảng sau: - Các ion kim loại có vai trò cần thiết bắt buộc cho sự hoạt động của enzyme. Các ion (cation) có chức năng giống với các coenzyme. Người ta gọi các ion kim loại đó là các coenzyme đơn giản. Các enzyme cần ion kim loại cho việc thực hiện chức năng của mình được gọi là metalloenzyme. Chức năng của các ion kim loại nói chung phần nhiều là chúng tạo ra các phức hợp kiểu chelate giữa một nhóm nhất định nào đó của cơ chất và enzyme. Trước tiên các cation tạo phức “ion kim loại – cơ chất”, sau đó phức hợp này mới phản ứng với enzyme. Các ion Ca, Cu, Mg, Mn, Mo, Zn, … đều là những ion tham gia trong sự hoạt động của các enzyme. 1.1.2.3. Trung tâm hoạt động(TTHĐ) của enzyme - Là bộ phận dùng để liên kết với cơ chất. - Chỉ chiếm tỉ lệ rất bé so với thể tích toàn bộ của enzyme. - Gồm các nhóm chức của amino acid ngoài ra có thể có cả các ion kim loại và các nhóm chức của các coenzyme. Đối với enzyme một thành phần: TTHĐ chỉ gồm những nhóm chức của các amino acid như nhóm hydroxy của serin, carboxy của glutamic, vòng imidazol… Các nhóm chức của các amino acid có thể xa nhau trong chuỗi polypeptide nhưng nhờ cấu trúc không gian nên nó gần nhau về mặt không gian. Đối với enzyme hai thành phần: TTHĐ cũng như trên, các nhóm chức của các amino acid tham gia tạo thành TTHĐ liên kết với nhau bằng các liên kết hydro. Ngoài ra trong TTHĐ của loại này còn có sự tham gia của coenzyme và có thể cả ion kim loại. Theo Fisher TTHĐ có cấu trúc cố định, khi kết hợp với cơ chất để tạo phức E-S ta có thể hình dung giống như chìa khóa và ổ khóa. Ngày nay người ta đã chứng minh được rằng: TTHĐ của enzyme chỉ có cấu tạo hoàn chỉnh khi có sự tương tác với cơ chất (thuyết tiếp xúc cảm ứng của Koshland). 1.1.3. Cơ chế xúc tác của enzyme Khi đặt vấn đề nghiên cứu về cơ chế xúc tác của enzyme người ta xuất phát từ giả thiết cho rằng trong các phản ứng được enzyme xúc tác, phức tạm thời “Enzyme – Cơ chất” được tạo thành. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: Ở giai đoạn 1 phản ứng xảy ra tương đối nhanh, cơ chất (S) được liên kết với enzyme (E) nhờ các liên kết yếu. Lúc này sự liên kết không gian giữa các phân tử cơ chất và enzyme chưa đủ hiệu quả đối với sự xúc tác của enzyme. Ở giai đoạn tiếp theo xảy ra sự biến đổi của cơ chất (S) có liên quan tới việc phá vỡ hay hình thành các liên kết cộng hóa trị. Ở giai đoạn này, cơ chất được hoạt hóa (một hoặc vài phức chất ES chuyển tiếp được hoạt hóa). Ở đây, cấu trúc bậc 3 của enzyme luôn biến đổi tạo khả năng tiếp xúc giữa các nhóm hoạt động của enzyme với cơ chất đang biến đổi. Enzyme đã làm biến đổi phần tử cơ chất làm cho các liên kết bên trong phân tử trở nên “lỏng lẻo” hơn, do đó chỉ cần một lượng năng lượng nhỏ cũng đủ làm cho cơ chất biến thành các sản phẩm (P) khác nhau. Người ta đã chứng minh rằng trong khi hình thành phức chất ES có 2 quá trình đồng thời xảy ra nhanh chóng đó là: a) Sự thay đổi mật độ điện tử gây nên sự phân cực hóa các liên kết. b) Sự biến dạng về mặt hóa học của các liên kết “kéo căng” trong phân tử cơ chất. Cả hai yếu tố này (sự biến hình và sự phân cực hóa các liên kết đồng hóa trị) đều làm tăng thế năng nhiệt động học của các liên kết này, nghĩa là xúc tiến việc vượt qua “hàng rào” năng lượng hoạt hóa của quá trình chuyển tiếp phức “Enzyme-Cơ chất”. 1.2. Danh pháp và phân loại enzyme 1.2.1. Danh pháp Trong thời gian cơ chế tác dụng của enzyme chưa được nêu ra, người ta đã đặt cho một số enzyme những tên riêng biệt như pepsine, trypsine, chymotrypsine, papaine, bromeline, … Khi con số các enzyme được biết ngày càng nhiều tên enzyme được gọi theo nguyên tắc sau đây: Tên enzyme = tên cơ chất mà enzyme xúc tác + loại phản ứng mà enzyme xúc tác + tiếp vị ngữ “ase”. Việc phân loại enzyme là công việc khó khăn vì số enzyme mà cơ chế xúc tác của nó được hiểu biết một cách tường tận không nhiều. Việc phân loại enzyme được dựa theo nguyên tắc là: lấy cơ sở kiểu phản ứng do enzyme xúc tác mà Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế đã đề xuất năm 1964. Năm 1973 hệ thống phân loại này lại tiếp tục được hoàn thiện bởi Ủy ban danh pháp Hóa sinh thuộc Hiệp hội hóa học cơ bản và ứng dụng Quốc tế (IUPAC). Trên cơ sở đó tất cả các enzyme được phân chia 6 nhóm chủ yếu sau: 1. Oxydoreductase 4. Lyase 2. Transferase 5. Isomerase 3. Hydrolase 6. Synthetase (Ligase) Các số thập phân trên bảng phân loại có ý nghĩa như sau: - Số thứ nhất chỉ nhóm chính (Ví dụ nhóm 2: transferase) - Số thứ hai qui định một số đặc tính của phản ứng (Ví dụ: 2.1 cho biết enzyme vận chuyển gốc 1 carbon) - Số tiếp theo cho biết chi tiết hơn (Ví dụ 2.1.1: có nghĩa là enzyme vận chuyển nhóm methyl…) Tuy nhiên cho đến nay các tên gọi truyền thống của enzyme vẫn còn được sử dụng. 1.2.2. Phân loại enzyme, giới thiệu một số enzyme thuộc mỗi loại 1.2.2.1. Oxydoreductase (các enzyme oxy hóa khử) Các enzyme nhóm này làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử. Chúng chuyển vận H+ hay các điện tử và xúc tác cho sự oxy hóa sinh học. Các enzyme này có vai trò to lớn trong quá trình hô hấp và trao đổi năng lượng trong cơ thể. Sơ đồ tổng quát của các phản ứng được xúc tác bởi oxydoreductase như sau: Trong đó AH2 là cơ chất; B là chất nhận H nào đó, có thể là O2. Trong tế bào oxydoreductase tạo nên các hệ thống (được gọi là chuỗi enzyme oxy hóa khử), trong đó việc vận chuyển các nguyên tử hydro (H+ và e-) qua nhiều giai đoạn, từ cơ chất đến chất nhận cuối cùng là O2. Kết quả là các nguyên tử hydro được vận chuyển đến O2 và sẽ tạo thành H2O. Sơ đồ hệ thống enzyme hô hấp và việc vận chuyển H +và e- được trình bày tổng quát sau đây: Tùy theo khả năng của oxydoreductase chuyển H2 vừa lấy được từ cơ chất (AH 2) đến O2 của không khí, người ta chia oxydoreductase thành hai phân nhóm: - Dehydrogenase háo khí (oxidase) - Dehydrogenase yếm khí. a) Dehydrogenase yếm khí: là những enzyme không có khả năng vận chuyển H+ và e- từ cơ chất oxy hóa đến trực tiếp cho O2 của không khí, mà chúng sẽ chuyển H + và e- đó cho các chất vận chuyển trung gian khác. Nhóm ghép của dehydrogenase yếm khí là dẫn xuất của vitamin PP (B5) đó là NAD và NADP. b) Dehydrogenase háo khí: là những enzyme có khả năng vận chuyển H +và e- đến trực tiếp cho O2 của không khí. Chúng cũng là những enzyme hai thành phần. Nhóm ghép của chúng là dẫn xuất của vitamin B2 (Riboflavin) đó là FMN và FAD. Các enzyme chứa FMN, FAD thường không oxy hóa trực tiếp cơ chất mà chúng lấy H 2 từ NADH2 (hoặc từ NADPH2) rồi chuyển điện tử cho hệ cytochrome.Đa số enzyme chứa FMN khi tác dụng trực tiếp với O2 không khí sẽ tạo thành H2O2. Ví dụ: enzyme glycolatoxidase xúc tác cho phản ứng oxy hóa glycolic acid theo sơ đồ sau: 1.2.2.2. Nhóm transferase (các enzyme vận chuyển) Các enzyme nhóm này làm nhiệm vụ vận chuyển các nhóm hóa học từ hợp chất này sang hợp chất khác mà không làm thay đổi hóa trị của các nguyên tố. Sơ đồ tổng quát: x: là nhóm được vận chuyển. Tùy thuộc vào x mà ta có các tên enzyme vận chuyển khác nhau. Ví dụ: Acyltransferase: x là gốc các acid béo trong đó có gốc acetic acid. Đây là enzyme hai thành phần trong đó nhóm hoạt động là HS-CoA có cấu tạo như sau: - Glycozyltransferase: Nếu x là gốc glycozyl. - Aminotransferase: Nếu x là nhóm amin (– NH2 ). - Methyltransferase: Nếu x là nhóm (CH3). - Aldotransferase: Nếu x là nhóm aldehyd. - Cetotransferase: Nếu x là nhóm cetone. - Phosphotransferase: Nếu x là gốc H3PO4. Enzyme này còn có tên là: a) Kinase: Nếu xúc tác cho phản ứng chuyển gốc H3PO4 mà ATP là nhóm hoạt động của enzyme này. Ví dụ: b) Mutase: là enzyme vận chuyển gốc H3PO4 trong nội tại phân tử của 1 chất. Ví dụ: Enzyme hexoso(P)-mutase xúc tác cho phản ứng sau: 1.2.2.3. Nhóm hydrolase (các enzyme thủy phân): Các enzyme nhóm này xúc tác cho các phản ứng thủy phân. Sơ đồ tổng quát: Dựa vào liên kết giữa R1 và R2 mà ta có tên các enzyme thủy phân khác nhau: - Peptidase: Thủy phân liên kết peptide. - Glycosidase: Thủy phân liên kết glycoside. - Esterase: Thủy phân liên kết ester. - Amidase: Thủy phân amide. 1.2.2.4. Nhóm Liase (các enzyme phân cắt) Enzyme nhóm này phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi một hợp chất mà không có sự tham gia của H2O. Có trường hợp kết quả của phản ứng là tạo liên kết đôi. Ví dụ: * Decarboxylase: xúc tác cho phản ứng sau: 1.2.2.5. Nhóm Isomerase (các enzyme đồng phân hóa): Các enzyme nhóm này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa các chất hữu cơ thành đồng phân của chúng. Ví dụ chuyển hóa giữa dạng cetone và dạng aldehyd. Giữa dạng L và dạng D… Ví dụ: Enzyme trioso(P)isomerase xúc tác cho phản ứng sau: Enzyme alaninracemase xúc tác cho phản ứng biến đổi L-alanine thành D-alanine và ngược lại. 1.2.2.6. Nhóm synthetase (các enzyme tổng hợp) Các enzyme nhóm này xúc tác cho các phản ứng tổng hợp các chất hữu cơ. Nhóm này chỉ xúc tác khi có mặt của ATP và các hợp chất cao năng khác. Vì các phản ứng tổng hợp đòi hỏi phải cung cấp nhiều năng lượng. Một số ví dụ sau đây: 1.3. Một số tính chất của enzyme 1.3.1. Cường lực xúc tác enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của môtj chất xúc tác. Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với xúc tác thông thường . Ví dụ: - 1 mol Fe3+ xúc tác phân ly được 10-6 mol H2O2/phút. Một phân tử catalase có một nguyên tử Fe xúc tác phân ly 5.106 mol H2O2/phút, - 1 g pepsin trong 2 giờ thủy phân 5 kg protein trứng luộc ở nhiệt độ bình thường. - 1 phân tử  - amylase sau 1 giây có thể phân giải 4.000 liên kết glucosid trong phân tử tinh bột 1.3.2. Tính đặc hiệu của enzyme Khả năng xúc tác với tính đặc hiệu cao là một trong những đặc tính cơ bản và quan trọng nhất của enzyme. Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở chỗ: enzyme chỉ xúc tác cho một trong vô số những chuyển hóa có thể có được đối với các chất. Có hai loại đặc hiệu cơ bản đó là đặc hiệu phản ứng và đặc hiệu cơ chất. 1.3.2.1. Tính đặc hiệu phản ứng: được thể hiện ở chỗ enzyme chỉ có khả năng lựa chọn một dạng phản ứng trong số các phản ứng và xúc tác cho phản ứng đó. Điều đó thấy rõ trong ví dụ sau đây: Dưới tác dụng của oxidase, aminoacid bị khử amine hóa bằng cách oxy hóa để tạo ra cetoacid và NH3. Với sự có mặt của oxidase, một phản ứng khác khử carboxyl hóa lại không thể xảy ra. Việc xúc tác này đòi hỏi phải có enzyme khác, đó là decarboxylase. Cũng như vậy, phản ứng chuyển amine hóa đòi hỏi phải có transaminase. 1.3.2.2. Tính đặc hiệu cơ chất: Enzyme có thể lựa chọn đối với các chất tham gia phản ứng. Không phải mọi cơ chất có khả năng phản ứng đều được enzyme “tiếp nhận” như nhau. Mỗi enzyme chỉ chuyên xúc tác cho một hoặc một vài cơ chất nhất định và mức độ đặc hiệu của nó tùy thuộc vào từng loại enzyme. Có 3 mức độ đặc hiệu cơ chất chủ yếu: a) Đặc hiệu tương đối: Enzyme chỉ có thể tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định mà không phụ thuộc vào các nhóm hóa học nằm ở hai bên liên kết. Ví dụ các esterase có thể tác dụng lên hàng loạt các ester của phosphoric acid. b) Đặc hiệu nhóm: biểu hiện là enzyme chỉ có thể tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định và một trong hai nhóm nằm ở hai bên liên kết cũng phải có cấu tạo nhất định. Ví dụ carboxylpeptidase có khả năng phân hủy liên kết peptide gần nhóm –COOH tự do, nghĩa là liên kết peptide ở cuối mạch polypeptide, … c) Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ tác dụng lên một kiểu liên kết nhất định và các nhóm hóa học ở hai bên liên kết cũng phải xác định. Ví dụ: Enzyme trypsine thủy phân các liên kết peptide giữa lysine hoặc arginine với bất cứ aminoacid nào. Sản phẩm là những đoạn peptide có lysine hoặc arginine chứa nhóm COOH tự do ở phía tận cùng của peptide. - Enzyme Trombine còn có tính đặc hiệu cao hơn trypsine: nó chỉ thủy phân liên kết peptide ở phía carboxyl của gốc arginine nào có gốc glycine đứng liền kề sau nó: 1.3.2.3. Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất. Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất. Ví dụ, phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác dụng của fumarate hydratase chỉ xảy ra đối với L-malic acid mà không tác dụng lên D-malic acid. Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis hoặc trans. Ví dụ: enzyme fumarate hydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của fumaric acid mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành L-malic acid. Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng. Ví dụ, lactate racemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau giữa Dvà L-lactic acid, aldo-1-epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa -D-glucose thành -Dglucose, maleinate cis-trans isomerase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa giữa maleic acid (dạng cis) và fumaric acid (dạng trans), ... Các enzyme này có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thu. Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học. Ví dụ, hai nhóm -CH 2OH trong phân tử glycerol, glycerophosphate kinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerol (chứ không phải C1). 1.3.3. Đơn vị hoạt độ enzyme Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961. Đơn vị hoạt độ enzyme (UI) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1mmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 UI = 1mmol cơ chất (10-6 mol)/ phút. Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat) - Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phải đánh giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt độ riêng. - Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme. Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry. Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử. - Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian. Hoạt độ phân tử lớn (còn gọi là con số chuyển hóa hoặc con số vòng: turnover number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh. Như vậy, hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn. Ví dụ người ta đã xác định được hoạt độ phân tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x 10 6) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), b-amylase (1,2 x 106). Cũng cần chú ý rằng trong một số trường hợp định nghĩa về đơn vị hoạt độ enzyme ở trên không thể áp dụng được. Nếu cần thiết chúng ta sẽ đưa ra các điều kiện thí nghiệm tương đối hoặc định nghĩa của các đơn vị khác. Ở nơi có nhiều hơn một mối liên kết của phân tử cơ chất bị tấn công thì một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một micro - đương lượng của nhóm liên quan sau 1 phút ở điều kiện xác định. Ở nơi có hai phân tử giống nhau phản ứng với nhau thì 1 đơn vị hoạt độ là lượng enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa của 2 mmol cơ chất sau 1 phút 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ, pH của môi trường, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác, ... Điều đáng lưu ý là các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu giống như các phản ứng hóa học thông thường mà còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của chúng đối với cấu trúc phân tử enzyme. 1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E], v= K[E] có dạng y=ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác. Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó. Hình 1.1. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 1.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES. Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S. Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm). v1 = k1[E][S] v-1 = k -1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có: k -1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k -1+k2)[ES] = k1[E][S] Gọi E0 (2) là nồng độ E ban đầu: [E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k -1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S] k1 [E0] [S] [ES] = -------------k -1+ k2+k1[S] Nếu đặt Km= k -1+k2/ k1 (Km: gọi là hằng số Michalis Menten) (3) Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S] Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2[ES] Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được: k2[E0] [S] v = ----------------- (4) Km + [S] Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là: Vmax= k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: [S] v = Vmax ------------- (5) Km+ [S] Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. K m đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ tối đa. Thay V và v bằng các con số tương ứng 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó. Như vậy, K m được đo bằng đơn vị nồng độ, tức mol/l. Hằng số Michaelis là một hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực của enzyme với cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực này càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì tốc độ tối đa V đạt ở giá trị nồng độ cơ chất càng thấp. Trên cơ sở phương trình Michaelis-Menten, bằng cách xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của v vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa V ta có thể tìm thấy giá trị của [S], ở đó v = V/2, tức giá trị của Km (hình1.2). Hình 1.2. Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]. Khi Km = [S] thì v0 =1/2 Vmax Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu kìm hãm enzyme. Hình 1.3. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver - Burk Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có 2 hay nhiều cơ chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng: ATP + glucose hexokinase ADP + glucose 6 phosphate Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng 2 cơ chất có thể như sau: a/ Cơ chế tạo phức 3 thành phần b/ Cơ chế không tạo phức 3 thành phần Đây là trường hợp cơ chất thứ 2 (S2) chỉ kết hợp vào enzyme ( ở trạng thái E’) sau khi P1 được tạo thành. Vận tốc của phản ứng trong trường hợp này có thể được phân biệt qua hằng số MichalisMenten đối với mỗi cơ chất. Qua nghiên cứu động học cho thấy: Phản ứng 2 cơ chất (bisubstrate) thường vận chuyển 1 nguyên tử hay 1 nhóm chức từ cơ chất này đến cơ chất khác. Khi cho S2 không đổi, đường biểu diễn tốc độ trong cả hai trường hợp 1.4.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitior) Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. 1.4.3.1. Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition) Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dung lên trung tâm hoạt động của enzyme, Chất kìm hãm choán chỗ của cơ chất ở enzyme. Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn. Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn giữa chất kìm hãm và cơ chất có sự tương đồng về mặt hóa học. ví dụ: malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatdehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic acid thành fumaric acid. Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm. Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzyme. Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax 1.4.3.2. Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự do. 1.4.3.3. Kìm hãm hỗn tạp (Mixed inhibition) Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. Hiện tượng kìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm. Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất kìm hãm là cao hơn khi có mặt chất kìm hãm. Giá trị Km thay đổi không giống như trong trường hợp cạnh tranh. Tương tự như trên ta có phương trình : Hình 1.7. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm hỗn tạp Các giá trị a , a’ được định nghĩa như trên. Trường hợp a = a’ gọi là không cạnh tranh (noncompetitive). Bảng 1.1. Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm lên Vmax và Km Cạnh tranh Phi cạnh tranh Hỗn tạp (Competitive) (Uncompetitive) (Mixed) Không cạnh tranh (Noncompetitive) Vmax không ảnh hưởng giảm giảm giảm Km tăng giảm tăng không ảnh hưởng Trường hợp kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là “kìm hãm cơ chất” như kìm hãm urease khi nồng độ ure cao, ngoài ra còn có các enzyme khác như lactatdehydrogenase, carbonxypeptidase, lipase, pyrophotphatase, photphofructokinase (đối với ATP). Nguyên nhân của những hiện tượng này còn chưa được biết rõ. Đó có thể là: + Tồn tại nhiều trung tâm liên kết với cơ chất bằng các ái lực khác nhau. Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ liên kết với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó liên kết với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động. + Cơ chất cũng có thể được liên kết nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme. Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác còn có trung tâm điểu chỉnh. + Cơ chất có thể liên kết với một chất hoạt hóa và bằng cách này nó tách khỏi E. + Cơ chất có thể choán chổ (ngăn cản) một cofactor hay một coenzyme. + Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó làm mất đi tính chuyên hóa của enzyme. 1.4.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator) Chất này làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme. Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn. Ví dụ: tác dụng của anion chloride, brom, iode đến hoạt độ của -amylase động vật; tác dụng của một số ion kim loại như Mn++, Zn++, ... đối với hoạt độ của các protease ... Mg++ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ. Tuy nhiên tác dụng kích hoạt chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt độ enzyme. Gluthation dạng khử (Glu-Cys-Gly) có tác dụng khử liên kết disulfide thành nhóm sulhydryl tự do (-SH) cho nên cũng có tác dụng hoạt hóa nhiều enzyme. Các chất đã nêu thường kết hợp trực tiếp với phân tử enzyme, làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Một số chất khác có thể tác dụng theo cách gián tiếp, ví dụ loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản ứng. Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại: + Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định. + Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối. + Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion. + Phụ thuộc nồng độ cation kim loại . + Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích. + Phụ thuộc bản chất cation kim loại. 1.4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant -Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần. Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-50 0C xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hóa sinh với các phản ứng vô cơ thông thường. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C, cũng có enzyme có nhiệt độ tối thích rất cao như những enzyme của những chủng ưa nhiệt. 1.4.6. Ảnh hưởng của pH Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối thích, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác có dạng như hình 7.9: Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau: a/ Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp. b/ Ở hai sườn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme. c/ Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất. d/ Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực đại. Nhờ xác định Vmax và Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận định lại bản chất của các nhóm tham gia vào liên kết cơ chất và quá trình tự xúc tác. 1.4.7 . Ảnh hưởng các yếu tố khác Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất. Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ. Ví dụ: dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính. Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá hủy càng mạnh. Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme. Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng. 1.5. Một số enzyme ứng dụng trong chế biến thực phẩm 1.5.1. Enzyme amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: R-R’ + H-OH  R-H + R’-OH Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: - Endoamylase ( enzyme nội bào) Exoamylase ( enzyme ngoại bào) Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase ( hay αdextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. 1.5.1.1. Đặc tính của enzyme amylase: Tính chất vật lý: - Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 D - Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. - Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. - Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). Cấu tạo: Mỗi loại -amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. -amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme. α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. -amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử -amylase đều có chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam Ca/1 mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Do có hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg 2+ cao nên -amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu 2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ ,Sn2+, không có ảnh hưởng mấy đến enzyme -amylase. Riêng -amylase của Asp.Oryzae (thuộc chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae) có chứa phần phi protein là poly saccharide, nhưng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. -amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công vào những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân -amylase nấm mốc là glucose và maltose. -amylase của nấm sợi không tấn công vào liên kết -1,6 glucoside của amilopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme -amylase phân cắt tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh.Sản phẩm thủy phân cuối cùng của thủy phân -amylase nấm sợi là maltose và maltotriose. 1.5.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme -amylase: -amylase (1,4--glucan-glucanhydrolase) có khả năng phân cách các liên kết -1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hay glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Quá trình thủy phân tinh bột bởi -amylase là một quá trình đa giai đoạn: - Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo một lượng lớn phân tử -dextrin. Độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh chóng. - Sang giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các phân tử -dextrin tiếp tục bị thủy phân tạo ra các tetra-trimaltose không màu với thuốc thử iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi -amylase cho đến khi tạo thành các disaccharide và cuối cùng là monosaccharide. Maltotetrose Amylose  Dextrin  Maltotriose Malto  13%glucose 87% maltose 19% glucose Amylopectin  72% maltose 8% isomaltose Dextrin phân tử thấp Tóm lại, dưới tác dụng của -amylase, tinh bột có thể chuyển thành glucose, maltose, maltotetrose, dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường -amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp,và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao là một đặc trưng cơ bản của -amylase, do vậy người ta còn gọi -amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. 1.5.1.3. Ứng dụng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triễn mạnh trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzyme ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,… và một số enzyme đặc biêt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này. Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế: Ứng dụng amylase trong sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm. Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không sử dụng hoàn tòan 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trịnh lên men. Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột .Enzyme này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp. Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzyme cellulose có tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thóat ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzyme khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzyme này được sử dụng để loại trừ O2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều. Ứng dụng amylase trong sản xuất rượu: Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau.Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Qúa trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa. Giai đoạn đường hóa: Người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid ). Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay amylase của malt để sản xuất cồn. Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt (mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu. Giai đoạn rượu hóa: Nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem đây là một quá trình áp dụng enzyme. Qúa trình rượu hóa là quá trình hết sức phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau. Điểm khác với enzyme amylase là ở chổ các enzyme tham gia quá trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa bởi enzyme trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường. 1.5.2. Enzyme Protease Protease (peptit – hidrolase 3.4) là tên gọi chung cho nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin, pepton hoặc di-tripepton. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Các loại protease Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính : - Serine proteases - Threonine proteases - Cysteine proteases - Aspartic acid proteases - Metalloproteases - Glutamic acid proteases Hiện sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Việc sử dụng trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống. Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống là chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ trong chống táo bón…mà thực chất là sử dụng papain, bromelain, fixin. Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẩy mầm để làm mềm thịt. Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công 1nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả tính năng của protease. Protease là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi. Người ta còn khai thác tính đông tụ như của renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm như trong sản xuất phomat. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. 1.5.3. Enzyme Pectinase Pectinase là nhóm enzym xúc tác cho sự thủy phân pectin, đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, nhất là trong công nghiệp sản xuất các loại nước ép trái cây. Ðặc biệt, dạng enzyme cố định được sử dụng rất hiệu quả vì có nhiều ưu điểm hơn hẳn dạng enzyme thông thường (enzyme hòa tan). Pectinase đã được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang. - Sản xuất nước quả và nước uống không có rượu. - Sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt. - Sản xuất nước giải khát. - Sản xuất cà phê. Chế phẩm pectinase được sử dụng trong sản xuất nước quả từ các nguyên liệu quả nghiền hay để làm trong nước quả ép. Bởi vì khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thóat ra được. Nhờ pectinase mà nước quả trong suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng. Pectinase còn góp phần chiết rút các 2chất màu, tanin và các chất hòa tan khác, do đó làm tăng chất lượng của thành phẩm. Những nghiên cứu cho thấy khi ép nho có xử lý bằng pectinase không những làm tăng hiệu suất mà còn làm tăng màu sắc. Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đông… nhờ pectinase mà dịch quả có nồng độ đậm đặc hơn. Cũng giống như protease, chế phẩm pectinase được thu nhận từ vi sinh vật, nấm mốc, xạ khuẩn… đặc biệt là các chủng nấm Asp. Ficuum và Asp. Niger có khả năng tổng hợp pectinase cao nhất. 1.5.4 . Enzyme Cellulase Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu,phế liệu của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Cellulase là enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hoá Cellulose thành các sản phẩm hoà tan. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa. Chế phẩm cellulase thường dùng để: - Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc. - Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển… Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agaragar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao. CHƯƠNG 2. SỰ TRAO ĐỔI CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG SINH HỌC Trao đổi chất và trao đổi năng lượng là bản chất của hoạt động sống của mọi cơ thể sinh vật, là biểu hiện tồn tại sự sống. Sự trao đổi chất của cơ thể luôn gắn liền với sự trao đổi và chuyển hóa năng lượng. Chính vì vậy, trao đổi chất và trao đổi năng lượng là hai mặt của một quá trình liên quan chặt chẽ với nhau. 2.1. Khái niệm chung về sự trao đổi chất và năng lượng sinh học 2.1.1. Sự trao đổi chất Cơ thể sống tồn tại, phát triển trong môi trường và không ngừng liên hệ mật thiết với môi trường đó. Nó hấp thụ các chất khác nhau từ môi trường ngoài, làm biến đổi các chất đó và một mặt tạo nên các yếu tố cấu tạo của bản thân cơ thể sống, mặt khác lại thải vào môi trường các sản phẩm phân giải của chính cơ thể cũng như các sản phẩm hình thành trong quá trình sống của cơ thể. Quá trình đó thực hiện được là do các biến đổi hóa học liên tục xảy ra trong cơ thể. Người ta gọi toàn bộ các biến đổi hóa học đó là sự trao đổi chất. Sự trao đổi chất bao gồm nhiều khâu chuyển hóa trung gian. Các quá trình này xảy ra phức tạp trong từng mô, từng tế bào bao gồm hai quá trình cơ bản là đồng hóa (tổng hợp) và dị hóa (phân giải) tạo nên chu kỳ trao đổi chất liên tục giữa chất nguyên sinh và chất nhận vào. Quá trình đồng hóa là sự hấp thụ các chất mới từ môi trường bên ngoài, biến đổi chúng thành sinh chất của mình; biến đổi các chất đơn giản thành chất phức tạp hơn, sự tích lũy năng lượng cao hơn. Đây là quá trình biến đổi các chất không đặc hiệu (các chất hữu cơ của thức ăn như glucid, lipid, protein) từ các nguồn khác nhau (thực vật, động vật, vi sinh vật) thành các chất hữu cơ khác (glucid, lipid, protein) đặc hiệu của cơ thể. Đặc điểm của quá trình này là thu năng lượng. Năng lượng cần thiết cung cấp cho các phản ứng tổng hợp trên chủ yếu ở dạng liên kết cao năng của ATP. Hình … Quá trình chuyển hóa các chất dinh dưỡng Quá trình dị hóa là quá trình ngược lại của quá trình đồng hóa, là sự biến đổi các chất phức tạp thành các chất đơn giản và giải phóng năng lượng cần thiết cho hoạt động sống. Như vậy đây là quá trình phân giải các chất dự trữ, các chất đặc trưng của cơ thể thành các sản phẩm phân tử nhỏ không đặc trưng và cuối cùng thành những chất thải (CO 2, H2O, NH3...) để thải ra môi trường. Năng lượng được tích trữ trong ATP và được sử dụng cho nhiều phản ứng thu năng lượng khác. Hình ….. Quá trình dị hóa Hai quá trình đồng hóa và dị hóa xảy ra liên tục liên quan với nhau và không tách rời nhau. Quá trình đồng hóa là quá trình đòi hỏi năng lượng cho nên đồng thời phải xảy ra quá trình dị hóa để cung cấp năng lượng cho quá trình đồng hóa. Do đó sự trao đổi chất và trao đổi năng lượng là hai mặt của một vấn đề. Tùy theo kiểu trao đổi chất, người ta chia sinh vật ra thành hai nhóm: nhóm sinh vật tự dưỡng và nhóm sinh vật dị dưỡng. Nhóm sinh vật tự dưỡng bao gồm tất cả các sinh vật tự tổng hợp chất dinh dưỡng cần thiết cho chúng. Để tồn tại và phát triển, nhóm này chỉ cần H 2O, CO2, muối vô cơ và nguồn năng lượng. Có hai hình thức tự dưỡng. Đó là hình thức tự dưỡng quang hợp và hình thức tự dưỡng hóa hợp. Hình thức đầu thể hiện ở cây xanh và vi khuẩn tía, vi khuẩn lưu huỳnh vốn dùng quang năng để tổng hợp chất hữu cơ. Hình thức sau được thể hiện ở một số vi khuẩn nhận năng lượng trong quá trình oxy hóa các chất vô cơ. Nhóm sinh vật dị dưỡng bao gồm các sinh vật không có khả năng tự tổng hợp chất dinh dưỡng từ các chất vô cơ mà phải sống nhờ vào các chất dinh dưỡng của nhóm sinh vật tự dưỡng tổng hợp nên. Như vậy, quá trình trao đổi chất của thế giới sinh vật liên quan chặt chẽ với nhau, tạo nên chu kỳ trao đổi chất chung. Ngoài cách chia trên, cũng theo kiểu trao đổi chất, người ta chia sinh vật thành hai nhóm lớn: nhóm hiếu khí (aerob) và nhóm kỵ khí (anaerob). Nhóm hiếu khí là kiểu trao đổi chất mà các quá trình oxy hóa có sự tham gia của oxy khí quyển. Nhóm kỵ khí là kiểu trao đổi chất mà các quá trình oxy hóa không có sự tham gia của oxy khí quyển. Đa số các sinh vật thuộc nhóm hiếu khí. Nhóm kỵ khí chỉ là một phần nhỏ của nhóm sinh vật dị dưỡng bậc thấp. Tuy vậy, giữa các cơ thể hiếu khí và kỵ khí không có ranh giới rõ ràng. Sinh vật hiếu khí biểu hiện rõ ràng nhất như người chẳng hạn cũng có thực hiện một phần các quá trình trao đổi chất theo con đường kỵ khí (ví dụ như mô cơ) Quá trình chuyển hóa trong cơ thể sống mang tính thống nhất và riêng biệt. Các con đường chuyển hóa lớn trong mọi cơ thể động vật, thực vật đơn bào, đa bào đều theo những giai đoạn tương tự nhau. Tuy vậy, nếu đi sâu vào từng mô, cơ quan, cá thể từng loài thì lại có những nét riêng biệt. Các phản ứng hóa học trong cơ thể xảy ra liên tục ở pH trung tính, nhiệt độ 37 0C, dưới tác dụng xúc tác của enzyme. 2.1.2. Sự trao đổi năng lượng Trao đổi chất luôn gắn liền với trao đổi năng lượng. Đối với cơ thể người, động vật và phần lớn vi sinh vật thì nguồn năng lượng duy nhất là năng lượng hóa học của các chất trong thức ăn. Trong cơ thể, các chất dinh dưỡng chủ yếu và quan trọng là glucid, lipide và protein đều bị oxy hóa. Lipide và glucide đi vào cơ thể bị “đốt cháy” sẽ sinh ra CO 2, H2O và NH3, chất này tác dụng với CO2 chuyển thành carbamid (ure). Các quá trình oxy hóa khử sinh học thuộc các phản ứng dị hóa có ý nghĩa rất quan trọng. Chúng không những chỉ là nguồn năng lượng quan trọng dùng để thực hiện các phản ứng tổng hợp khác nhau mà còn là nguồn cung cấp các hợp chất trung gian dùng làm nguyên liệu cho các phản ứng tổng hợp và đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc liên hợp các quá trình trao đổi chất. Để tồn tại và phát triển, cơ thể cần phải được cung cấp liên tục năng lượng. Trong hoạt động sống của mình, cơ thể biến đổi năng lượng từ dạng này sang dạng khác. So sánh về năng lượng sinh học và năng lượng kỹ thuật ta thấy có những đặc điểm sau: thứ nhất, cơ thể không sử dụng nhiệt năng thành công có ích được; thứ hai, sự giải phóng năng lượng trong cơ thể là dần dần, từng bậc; thứ ba, sự giải phóng năng lượng đi kèm theo sự phosphoryl hóa nghĩa là năng lượng giải phóng được cố định lại ở liên kết este với phosphoric acid trong phân tử ATP vốn được gọi là liên kết cao năng. Từ dạng năng lượng trung gian này (ATP) mà có thể dự trữ và sử dụng năng lượng vào các hoạt động sống; thứ tư, có thể không sử dụng được năng lượng tự do của tất cả các loại phản ứng phát nhiệt mà nguồn năng lượng duy nhất cơ thể sử dụng là của các quá trình oxy hóa. 2.1.2.1. Sự biến đổi năng lượng tự do Sự thay đổi về đại lượng của năng lượng tự do là một chỉ tiêu quan trọng nhất của hiệu ứng năng lượng tức là hệ số của tác dụng hữu hiệu của phản ứng. Có thể định nghĩa năng lượng tự do là lượng năng lượng mà ở một nhiệt độ nhất định nào đó có thể biến thành công. Tế bào có thể tạo ra và duy trì được cấu trúc trật tự và phức tạp của mình nhờ chúng liên tục tiếp nhận năng lượng tự do từ môi trường ở dạng quang năng hoặc hóa năng và biến hóa nó thành các dạng năng lượng sinh học để phục vụ cho các quá trình hoạt động sống. Sự biến hóa, tích lũy và sử dụng năng lượng sinh học xảy ra song song với sự chuyển hóa vật chất và tuân thủ các nguyên tắc của nhiệt động học. Những biến đổi năng lượng tự do của hệ thống phản ứng được ký hiệu bằng G có giá trị là Kcal/mol. Đại lượng của G là hiệu số giữa lượng năng lượng tự do của trạng thái cuối (sau phản ứng) G2 và năng lượng tự do của trạng thái đầu (trước phản ứng) G1. Nếu G<0 (có giá trị âm), phản ứng tỏa nhiệt, có thể xảy ra một cách tự phát. Ví dụ các phản ứng thủy phân đều thuộc loại phản ứng này. Nếu G = 0, hệ thống ở trạng thái cân bằng. Nếu G>0 (có giá trị dương), phản ứng thu nhiệt, muốn thực hiện phản ứng cần phải cung cấp năng lượng. Các phản ứng thu nhiệt chỉ có thể được thực hiện cùng với các phản ứng tỏa nhiệt, nghĩa là việc tăng năng lượng tự do chỉ có thể có được do các phản ứng liên hợp khác tiến hành với việc giảm năng lượng tự do. Các quá trình cơ bản gắn liền với hoạt động sống của cơ thể, nhiều kiểu làm việc của tế bào, các phản ứng tổng hợp đều là những phản ứng thu nhiệt luôn luôn liên hợp với các phản ứng tỏa nhiệt. G được tính theo công thức: G = G0 + RT lnK Trong đó: G0 - sự biến đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn của phản ứng ở 25 0C khi nồng độ của tất cả các chất phản ứng là 1 mol và áp suất là 101,3 KPa (1atm) R - hằng số khí T - nhiệt độ tuyệt đối K là hằng số cân bằng của phản ứng bằng [C]c. [D]d/[A]a[B]b tức là nồng độ của các chất tham gia phản ứng A + B  C + D; a, b, c, d là số lượng phân tử A, B, C, D tham gia phản ứng. Trong hệ thống sinh học, khi tính giá trị G0 cần chú ý đến pH, ở nồng độ H+ là 1 mol, pH = 0. Trạng thái ion hóa của nhiều hợp chất sinh học bị biến đổi khi pH thay đổi. Vì vậy, để thuận tiện cho việc tính toán, xem trạng thái chuẩn pH = 7 và ký hiệu sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn ở pH = 7,0 là G0'. 2.1.2.2. Liên kết cao năng và vai trò của ATP Các liên kết hóa học giữa các nguyên tử đều là những tác nhân mang chủ yếu của năng lượng tự do trong các chất hữu cơ. Vì vậy, trong việc biến tạo của các liên kết hóa học trong phân tử, mức năng lượng tự do của hợp chất sẽ thay đổi. Xét về mặt năng lượng trong các hợp chất hữu cơ có hai loại liên kết: Liên kết thường và liên kết cao năng (liên kết giàu năng lượng). Liên kết thường là liên kết mà khi phân giải hoặc tạo thành nó có sự biến đổi năng lượng vào khoảng 3 Kcal trên một phân tử gam (Ví dụ: liên kết este); còn đối với liên kết cao năng sự biến đổi này lớn hơn nhiều từ 7 – 12 kcal/mol. Trong các hoạt động sống của cơ thể sinh vật, các quá trình tổng hợp các chất phân tử lớn từ các chất đơn giản, vận chuyển tích cực các chất qua màng tế bào, quá trình vận động v.v. luôn đòi hỏi năng lượng tự do. Trong hệ thống sống cần có các chất, các hệ thống nhận năng lượng tự do từ các quá trình này chuyển đến cho các quá trình khác. ATP là chất phổ biến giữ vai trò này, là chất có vai trò trung tâm trong trao đổi năng lượng ở tế bào và cơ thể sống, là chất liên kết hoặc có thể nói là mắt xích giữa hệ thống sử dụng năng lượng và hệ thống sản sinh ra năng lượng. Trong phân tử ATP có 3 gốc phosphate, 1 gốc kết hợp với gốc ribose qua liên kết este, 2 liên kết giữa 3 gốc phosphate là liên kết anhydric. Đó là các liên kết cao năng được ký hiệu bằng dấu “ ~ ”. ATP ( Adenosine Tri Phosphate) được biểu thị một cách khái quát như sau: (trong đó là các gốc phosphoric acid ). Khi cắt đứt các liên kết cao năng này, sẽ giải phóng số năng lượng lớn gấp hơn 2 lần so với liên kết este: Nếu tiếp tục thủy phân liên kết este của AMP để tạo thành adenosine và phosphate vô cơ, năng lượng tự do được giải phóng của phản ứng này thấp hơn nhiều. Sự chuyển hóa tương hỗ giữa ATP và ADP có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi năng lượng của hệ thống sống. Trong đa số trường hợp thường thấy phosphore hoặc sulphure tham gia tạo thành liên kết cao năng . Bảng 2.1. Một số dạng liên kết cao năng thường gặp 2.1.3. Sự phosphoryl hóa oxy hóa Quá trình tổng hợp ATP là quá trình phosphoryl hóa: ADP + H3PO4 → ATP Đây là quá trình cần năng lượng. Như chúng ta đã biết, mối liên kết cao năng trong ATP chứa năng lượng tự do là 7Kcal/mol nên để tổng hợp được ATP từ ADP theo phản ứng trên cần cung cấp năng lượng tương đương 7Kcal/mol. Nguồn năng lượng cung cấp cho quá trình phosphoryl hóa rất khác nhau. Sự phosphoryl hóa quang hóa là quá trình tổng hợp ATP ở lục lạp thể nhờ năng lượng ánh sáng xảy ra trong quang hợp. Sự phosphoryl hóa oxy hóa là quá trình tổng hợp ATP ở ty thể nhờ năng lượng thải ra trong các phản ứng oxy hóa khử. Theo quan niệm hiện nay, sự phosphoryl hóa oxy hóa là quá trình hình thành ATP bằng cách chuyển electron và proton trong chuỗi hô hấp tế bào 2.2. Trao đổi protein 2.2.1. Sự phân giải protein và amino acid 2.2.1.1. Phân giải protein Thủy phân là con đường phân giải protein phổ biến ở thực vật và động vật. Quá trình thủy phân protein xảy ra tại lysosome, nơi chứa nhiều enzyme thủy phân protein là protease. Quá trình thủy phân xảy ra qua 2 giai đoạn - Nhờ peptid-peptido hydrolase, protein bị thủy phân thành các đoạn peptid ngắn. - Nhờ peptid-hydrolase thủy phân tiếp các peptid thành amino acid. Kết quả chung là Ở động vật có vú, sự phân giải protein đầu tiên do tác động của pepsin. Tế bào niêm mạc dạ dày tiết ra pepsinogen. Nhờ pepsin và HCl của dịch dạ dày, pepsinogen biến đổi thành pepsin họat động và pepsin họat động sẽ thủy phân protein thành amino acid. 2.2.1.2. Phân giải amino acid Có nhiều con đường phân giải amino acid. Khử amine Bằng nhiều con đường khác nhau, các amino acid bị khử nhóm amine tạo ra các sản phẩm tương ứng. - Khử amine bằng các enzyme khử. Nhờ enzyme khử xúc tác, amino acid bị khử thành acid tương ứng và giải phóng NH3. Nhờ amino acid oxydase, amino acid bị oxi hóa để tạo ceto acid tương ứng và NH3 - Khử amine bằng con đường thủy phân. Nhờ tác dụng của enzyme thủy phân hydrolase, amino acid bị thủy phân tạo oxiacid tương ứng và NH3 Ngoài các con đường đó ra, aspartic acid còn bị khử amin bằng con đường khử nội phân tử nhờ enzyme dezaminase xúc tác Sản phẩm của con đường khử amine các amino acid là các loại acid tương ứng và NH3. Khử carboxyl Sự loại carboxyl của amino acid là cách phân giải amino acid rất phổ biến nhờ decarboxylase xúc tác Sản phẩm tạo ra là các amine, đó là các chất có họat tính sinh học cao có vai trò trong quá trình trao đổi chất, các hoạt động sinh lý của cơ thể như histamine. VD : Lysine bị khử CO2 tạo thành cacdarverin Chuyển vị amine Bằng con đường chuyển vị nhóm amine sang cho một cetoacid, amino acid biến đổi thành ceto acid tương ứng, phản ứng nhờ enzyme vận chuyển nhóm amin xúc tác amino transferase Phản ứng này thực hiện 2 chức năng: vừa phân giải 1 amino acid thành ceto acid, đồng thời tổng hợp mới amino acid khác từ ceto acid tương ứng. Trừ threonine và lysine, tất cả các amino acid còn lại đều có thể tham gia vận chuyển nhóm amine để biến đổi thành các ceto acid tương ứng Ví dụ: 2.2.2. Sinh tổng hợp amino acid 2.2.2.1. Amine hóa Một số acid béo không no và ceto acid có thể amine hóa để tạo nên amino acid tương ứng Về nguyên tắc, mọi amino acid đều có thể được tổng hợp bằng con đường này từ các acid tương ứng. Nhưng trong tế bào chỉ có 2 enzyme là glutamate dehydrogenase và pyruvate dehydrogenase có hoạt độ mạnh để thực hiện xúc tác loại phản ứng trên, còn các enzyme khác không có khả năng xúc tác cho nên trong thực tế chỉ có glutamic acid và alanin là 2 amino acid được tổng hợp bằng con đường này. 2.2.1.2. Amide hóa Từ 2 loại amino acid là aspactic acid và glutamic acid do có 2 nhóm carboxyl nên có thể được amide hóa để tạo amino acid mới, dạng amide của aspactic acid và glutamic acid là asparagine và glutamine 2.2.1.3. Tổng hợp amino acid nhờ ATP Quá trình tổng hợp amino acid nhờ ATP xảy ra qua 2 giai đoạn - NH3 + ATP → AMP ~ NH2 + P - P Đây là phản ứng họat hóa nhóm NH2 nhờ ATP. AMP ~ NH2 thực hiện phản ứng chuyển vị amine cho ceto acid để tạo amino acid tương ứng Thực chất đường hướng này cũng là hình thức amine hóa các ceto acid nhưng không sử dụng các dehydrogenase mà sử dụng ATP. 2.2.3. Các biến đổi của protein trong quá trình sản xuất và bảo quản thực phẩm 2.2.3.1. Biến đổi do nhiệt Các quá trình chế biến thực phẩm bao gồm đun nóng, làm lạnh, sấy, xử lý hoá chất, lên men, chiếu bức xạ và các quá trình xử lý khác. Trong đó, đun nóng là quá trình chế biến được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, đun nóng được thực hiện nhằm mục đích vô hoạt vi sinh vật và các enzyme nội sinh (endogenous enzyme) gây các phản ứng oxy hoá hoặc thuỷ phân không mong muốn khi bảo quản hoặc để biến đổi hỗn hợp các thành phần nguyên liệu thực phẩm không hấp dẫn thành sản phẩm thực phẩm có kết cấu đồng nhất và có sức lôi cuốn về mặt cảm quan. Hơn nữa, một số protein như - lactoglobulin và -lactalbumin từ sữa bò và protein từ đậu nành có thể gây dị ứng, trở thành vô hại nhờ quá trình này. Tuy nhiên, các ảnh hưởng có lợi nhờ quá trình đun nóng thực phẩm giàu protein nói chung thường đi kèm với một số ảnh hưởng xấu, làm giảm giá trị dinh dưỡng và các tính chất chức năng của protein. a. Gia nhiệt vừa phải Gia nhiệt vừa phải chỉ làm protein biến tính và giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, do: - Làm mất độc tính của các độc tố có bản chất protein (như enterotoxin cuả Staphyloccocus aureus) hoặc của các chất kìm hãm các enzym ñường tiêu hoá (như antitripxin Kunitz và Bowman có trong hạt đậu tương). - Làm vô hoạt các enzyme (protease, polyphenoloxidase, lipoxydase…) vốn xúc tác phản ứng phá huỷ các vitamin. - Làm tăng khả năng tiêu hoá của một số protein do làm duỗi mạch peptit của chúng, giải toả các gốc axit amin trước đây bị vùi trong phân tử, do đó tạo điều kiện cho protease tác dụng đ ược thuận lợi hơn.Vd.: colagen, glixinin đ ậu tương, ovalbumin… b. Thanh trùng o Gia nhiệt kiểu thanh trùng ở nhiệt độ lớn hơn 110-115 C các sản phẩm giàu protein như thịt, cá, sữa sẽ gây phá huỷ một phần các gốc xistin, xistein hình thành nên H2S, dimetylsulfua, axit xisteic và hợp chất bay hơi khác khiến cho các sản phẩm này có mùi đặc trưng. c. Gia nhiệt khan o Gia nhiệt khan protein ở nhiệt độ trên 200 C (nhiệt độ rán thịt và cá) tạo ra ,  hoặc  cacbolin do phản ứng vòng hoá của tryptophan: d. Gia nhiệt ở nhiệt độ cao o Gia nhiệt ở nhiệt độ cao (hơn 200 C) thực phẩm giàu protein có pH trung tính hoặc kiềm tính sẽ xảy ra:  Thuỷ phân các liên kết peptit và đồng phân hoá các gốc axit amin, tạo ra hỗn hợp raxemic do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng đi 50%, do các đồng phân D được tạo thành khó bị tiêu hoá hơn;  Phá huỷ một số axit amin: như arginin sẽ bị chuyển thành ornitin, ure, xitrulin và amoniac. Cistein bị chuyển thành dehydroalanin. Gia nhiệt ở môi trường kiềm, serine, treonin và lysine cũng bị phá huỷ;  Tạo cầu nối đồng hoá trị kiểu lyzinoalanin, ornitinoalanin hoặc lantionin liên kết gốc dehydroalanin (DHA) ở chuỗi polypeptit này với các gốc lyzin, ornitin hoặc gốc xistin ở chuỗi polypeptit khác. Gốc DHA được tạo ra do phản ứng loại  gốc xistein hoặc phosphoserin: Mạch polypeptit có chưá gốc lizin, gốc ornitin hoặc gốc xistein sẽ kết hợp với mạch polypeptit có chưá gốc DHA theo sơ đồ sau: Khi xử lý nhiệt thịt hoặc cá ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thanh trùng thì còn tạo ra cầu đồng hoá trị kiểu izopeptit giưã gốc lizin cuả chuỗi peptit này với gốc glutamic hoặc gốc aspartic cuả chuỗi peptit khác: Về phương diện dinh dưỡng, việc tạo ra cầu đồng hoá trị izopeptit trong cùng một phân tử hoặc giưã các phân tử sẽ làm giảm độ tiêu hoá cuả nitơ, giảm hệ số sử dụng protein và giá trị sinh học cuả protein. Hơn nưã do hiệu ứng không gian các cầu đồng hoá trị (glutaminlizyl hoặc aspartyl-lizyl) sẽ ngăn cản không cho các protease đến ñược vùng đặc hiệu để thuỷ phân do đó làm cho quá trình tiêu hoá protein bị chậm lại. 2.2.3.2. Thủy phân và sau thủy phân: Do ảnh hưởng pH môi trường bảo quản, độ ẩm, enzyme protease trong bản thân nguyên liệu hay vsv xâm nhập - protein  acid amin + peptide gây vị đắng - Các acid amin tiếp tục bị chuyển hóa qua các pư desamin, decacboxyl hóa tạo ra các hợp chất rượu, aldehyde, ceton, mercaptan gây màu và mùi, vị khó chịu, có thể gây ngộ độc a. Phản ứng khử amin b. Phản ứng khử cacboxyl c. Phản ứng khử amin + khử cacboxyl d. Phản ứng tạo mercaptan CH2-SH CH2-SH CH-NH2 + CO2 + NH3 CH 3 COOH ethylmercaptit e. Các phản ứng khác: -Các acid amin vòng chuyển hóa thành các sản phẩm độc có mùi khó chịu như scatol, indol, crezol, phenol. Tyr  crezol, phenol Tryp  scatol, indol -Lipoprotein  trimethylamin mùi tanh cá -Phopho protein, nucleoprotein  PH3 (phosphin), khí không màu, mùi thối, rất độc -His  Histamin ngộ độc -Phản ứng melanoidin: acid amin + đường khử  biến màu 2.2.3. 3. Các tác nhân khác: Do tác nhân môi trường: pH, độ ẩm, … protein bị biến tính dẫn đến kết tủa, vón cục, mất chức năng sinh học. Tuy nhiên biến tính protein cũng là cơ sở của nhiều quá trình chế biến như yaourt, pho mai, đậu hủ… 2.3. Trao đổi saccharide 2.3.1. Sự phân giải saccharide 2.3.1.1. Sự phân giải polysaccharide và disaccharide Ngoài biện pháp dùng acid để phân giải thì polysaccharide và disaccharide còn có thể bị phân giải bởi sự thủy phân hay bởi quá trình phosphoryl- phân (phosphorolysis). Sự thủy phân như phân giải tinh bột thành glucose, maltose hay dextrin tùy thuộc vào tính chất của enzyme: α-amylase chỉ cắt liên kết α-D-glucosidic-1,4 có khả năng cắt khoảng giữa, βamylase cũng chỉ cắt liên kết 1,4 nhưng có khả năng cắt bắt đầu từ đầu không khử,γ -amylase đặc biệt được tổng hợp từ vi sinh vật có khả năng cắt liên kết 1,4 và enzyme loại trừ (khử) sự phân nhánh (debranching enzyme, có họat tính glucosidase) cắt dây nối 1,6 trong amylopectin và glycogen. Các polysaccharide bị thủy phân bởi cac enzyme tương ứng khác như cellulose là cellulase, pectin là pectinase,... Với các disaccharide sẽ bị phân giải thành các monose nhờ các enzyme tương ứng như sucrose bởi sucrase để tạo thành glucose và fructose, maltose bởi maltase để tạo thành 2 phân tử glucose... Quá trình phosphoryl- phân (phosphorolysis) là quá trình tạo glucose-1-P nhờ enzyme phosphorylase (glycogen phosphorylase hay phosphorylase tinh bột) với sự hiện diên của ion phosphate. Phosphoryl- phân khác với sự thủy phân liên kết glucosidic là năng lượng giải phóng được dùng cho sự tạo liên kết ester trong glucose-1-P (Hình 2.1) Hình 2.1. Sự phosphoryl-phân để tạo glucose-1-phosphate Enzyme phosphorylase có coenzyme: Pyridoxal phosphate, nhóm phosphate tấn công như chất xúc tác acid, tấn công liên kết glucosidic bằng Pi . Phosphorylase tấn công vào đầu không khử của glycogen (hay amylopectin) đến khi cách chổ phân nhánh 4 đơn vị glucose thì ngừng lại. Chúng sẽ họat động trở lại sau khi enzyme loại trừ (khử) sự phân nhánh (debranching enzyme) thực hiện chức năng transferase và glucosidase. Các disaccharide cũng có thể bị phosphoryl-phân (phosphorolysis) bởi enzyme tương ứng để tạo ra một dẫn xuất phosphate của monose đồng thời giải phóng monose thứ hai. Ví dụ maltose phosphorylase chuyển hoá maltose thành glucose-1-P và glucose. 2.3.1.2. Sự oxy hoá monosaccharide Dưới tác động của hệ thống nhiều enzyme khác nhau có trong ty thể, các monosaccharide bị oxy hóa để tạo ra CO2, H2O, các hợp chất cao năng và các sinh chất trung gian khác cần cho các quá trình hóa sinh xảy ra trong cơ thể. Sản phẩm tạo thành phụ thuộc vào điều kiện môi trường: Hình 2.2. Sự phân giải glycogen bằng glycogen phosphorylase Quá trình phân giải kỵ khí( glycolysis) Quá trình này còn được gọi là quá trình Embden-Meyerhof-Parnas, đây là quá trình chuyển hóa hexose thành pyruvate trong điều kiện không có oxy, có thể khái quát sự chuyển hóa qua hai giai đọan gồm nhiều phản ứng trên hình 2.3. Phản ứng 1: Glucose được phosphoryl hóa ở C6 để cho sản phẩm glucose-6-P, nguồn phosphate là ATP. Trong điều kiện tế bào đây là phản ứng một chiều, được xúc tác bởi enzyme hexokinase. Kinase là tên chung được dùng cho các enzyme xúc tác chuyển gốc phosphate từ ATP cho các chất nhận, lớp phụ của transferase. Hexokinase không những xúc tác sự phosphoryl hóa glucose mà còn xúc tác sự phosphoryl hóa các hexose khác như fructose, manose. Hexokinase, cũng như các kinase khác cần Mg2+cho hoạt tính của nó vì cơ chất thật của enzyme không phải là ATP 4mà là ATP2- Hexokinase phổ biến ở tất cả các loại tế bào. Tế bào gan trưởng thành có chứa hexokinase gọi là hexokinase D hay glucokinase đặc hiệu cho glucose, khác với các dạng khác về động học và tính chất điều hòa. Phản ứng 2: Chuyển hóa glucose-6-P thành fructose-6-P Enzyme phosphohexose isomerase xúc tác sự chuyển hóa đồng phân glucose-6-P thành fructose-6-P, biến một aldose thành một ketose. Hình 2.3. Quá trình đường phân (glycolysis) Phản ứng 3: Phosphoryl hóa fructose-6-P thành fructose1,6 biphosphate Trong điều kiện của tế bào phản ứng do PFK-1 xúc tác là phản ứng một chiều. Ở vi sinh vật, sinh vật đơn bào (protista) và hầu hết hay tất cả thực vật đều có phosphofructokinase dùng P~P, không dùng ATP làm nguồn cung cấp phosphate để tạo fructose1,6 biphosphate Mg2+ Fructose-6-P + PPi Fructose1,6 biphosphate + Pi Phản ứng 4: Phân cắt Fructose 1,6 biphosphate Fructose1,6 biphosphate bị phân cắt thành triose phosphate :3-phosphate glyceraldehyde và dihydroxy acetonphosphate. Aldolase của mô động vật có xương không cần cation hóa trị 2, nhưng nhiều aldolase của vi sinh vật cần Zn2+ cho họat động của chúng. Glycogen, tinh bột, disaccharide, hexose đi vào pha chuẩn bị (preparatory phase) được thể hiện rõ ở hình 2.4. Phản ứng 5: Chuyển hóa nội phân tử triose phosphate Chỉ một trong hai triose phosphate là aldose: 3-P glyceraldehyde tham gia tiếp vào quá trình đường phân. Nhưng dihydroxyaceton-P có thể được chuyển hóa thành 3-P glyceraldehyde nhờ triose phosphate isomerase. Hình 2.4: Mối liên quan giữa quá trình đường phân và một số saccharide Phản ứng 6: Oxy hóa 3-P glyceraldehyde thành 1,3 biphosphoglycerate Xúc tác cho phản ứng này là enzyme 3-P glyceraldehyde dehydrogenase, có coenzyme NAD , trong trung tâm hoạt động có nhóm -SH + Cơ chế phản ứng đã được nghiên cứu đầy đủ: Sau khi tạo phức hợp E-S và NADH+H+, là phức không bền nên khi có mặt phosphate vô cơ nó sẽ tạo thành 1,3 biphosphoglycerate và giải phóng enzyme ở trạng thái tự do. Hình 2.5: Cơ chế tác động của glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase Phản ứng 7: Trong phản ứng này gốc phosphate cao năng của 1,3biphosphoglycerate chuyển cho ADP để tạo ATP (oxy hóa phosphory hóa mức cơ chất) và 3P glycerate Phản ứng 8: Chuyển hóa 3P glycerate thành 2P glycerate (chuyển gốc P nội phân tử) nhờ enzyme phosphoglycerate mutase cần Mg2+ cho hoạt động của nó. Đây là phản ứng thuận nghịch: Cơ chế: Phản ứng 9: 2P glycerate bị loại nước để tạo thành phosphoenolpyruvate, là phản ứng thuận nghịch được xúc tác bởi enzyme enolase. Phản ứng 10: Chuyển nhóm phosphate từ phosphoenolpyruvate đến ADP, phản ứng được xúc tác bởi pyruvat kinase, để tạo ATP và pyruvate. Pyruvat kinase bị kìm hãm bởi ATP, khi nồng độ ATP cao thì nó gây kìm hãm dị không gian. Ở động vật có xương sống pyruvat kinase có ít nhất 3 isozyme, hơi khác nhau trong phân bố ở các mô và trong việc đáp ứng đối với những chất điều hòa (modulator) . Từ pyruvate, tuỳ thuộc mỗi cơ thể, điều kiện môi trường có thể chuyển hóa thành các sản phẩm khác nhau (Động vật, thực vật và nhiều tế bào vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí). Từ pyruvate có thể có 3 khả năng phân giải như trên, ngoài ra nó còn là nguồn để tổng hợp + một số chất khác mà ta không đề cập ở đây. Trong điều kiện kị khí, pyruvate có thể lên men tạo lactic acid: Dưới tác dụng của lactate dehydrogenase, pyruvate bị khử thành lactic acid. Phản ứng này xảy ra trong mô cơ động vật sẽ tạo thành L-lactic acid, còn trong quá trình lên men do vi sinh vật gây ra (lên men sữa chua, muối dưa, cà …) sẽ tạo thành D-lactic acid. Lên men rượu: Nấm men và một số vi khuẩn khác có thể chuyển hóa pyruvate thành ethanol và CO2. Quá trình trải qua 2 bước Trong bước 1, pyruvate bị khử cacboxyl-hóa vốn được xúc tác bởi enzyme pyruvate decarboxylase, enzyme này cần Mg2+ và có coenzyme là TPP. Bước 2, acetaldehyde bị khử thành ethanol với NADH+H+được tạo ra từ sự oxy hóa khử 3 P glyceraldehyde. Quá trình phân giải háo khí glucose. Chu trình Krebs Có thể chia quá trình này ra làm 4 giai đoạn chính: - Phân giải glucose thành pyruvate (xem quá trình đường phân). - Chuyển hóa pyruvate thành acetyl- CoA. - Oxy hóa acetyl- CoA thông qua chu trình Krebs (chu trình citric acid). - Oxy hóa các coenzyme khử qua chuổi hô hấp(xem phần khái niệm về sự trao đổi chất). - Chuyển hóa pyruvate thành acetyl-CoA(hiếu khí) - Oxy hóa acetyl-CoA qua chu trình Krebs: Do trong chu trình cómặt các sản phẩm trung gian là các di- và tricarboxylic nên chu trìnhKrebs còn có tên là chu trình tricarboxylic, hay chu trình citric acid. Chu trình Krebs bao gồm 8 phản ứng sau (Hình 2.6). Phản ứng 1: Là phản ứng trùng hợp acetyl-CoA và oxaloacetate để tạo thành citrate. Năng lượng cần cho sự trùng hợp do sự phân giải liên kết cao năng trong acetyl-CoA cung cấp. Phản ứng 2: Citrate bị biến đổi thành isocitrate, là quá trình thuận nghịch được xúc tác bởi enzyme aconitase. Cis-aconitate thường không tách khỏi enzyme, ở tế bào thường tạo isocitrate vì isocitrate sẽ được chuyển hóa tiếp theo trong chu trình, dù cân bằng ở pH= 7,4, nhiệt độ 25oC chỉ có it hơn 10% isocitrate. Isocitrate có nhóm H-C-OH, mà chỉ 2 nguyên tử hydro ở vị trí này mới dễ dàng tách khỏi cơ chất để kết hợp với coenzyme NAD+ hoặc NADP+ . Phản ứng 3: Kết quả của sự oxy hóa dưới tác dụng xúc tác của enzyme isocitrate dehydrogenase là 2 nguyên tử hydro được chuyền cho NAD(P)+và 1 nguyên tử C được tách ra khỏi cơ chất dưới dạng CO2. Phản ứng 4: Sản phẩm α ketoglutarate vừa bị oxy hóa vừa bị khử carboyl hóa dưới tác dụng xúc tác của phức enzyme α-ketoglutaratedehydrogenase. Giống như phản ứng 3, NADH+H+, CO2 và succinyl CoA được tạo thành. Phản ứng 5: Năng lượng trong liên kết cao năng của succinyl CoA được dùng để tạo ATP thông qua GTP. Đây là chặng phản ứng duy nhất của chu trình Krebs xảy ra sự tích lũy năng lượng trong ATP. Phản ứng 6: Ở đây có sự kìm hãm cạnh tranh enzyme giữa succinate vàmalonate. Coenzyme khử FADH2 qua chuỗi hô hấp tạo ATP. Phản ứng 7: Là phản ứng hydrate hóa fumarate để tạo malate dướác dụng của enzyme fumarase. Fumarase có tính đặc hiệu rất cao, xúc tác sự hydrate hóa nối đôi của fumarate (dạng trans) mà không tác động lên maleate( đồng phân dạng cis của fumarate). Phản ứng 8: Malate tạo ra ở phản ứng 7 sẽ tiếp tục bị oxy hóa để cho ra oxaloacetate, enzyme xúc tác cho phản ứng này là malate dehydrogenase. Như vậy 1 vòng chu trình đã khép kín, oxaloacetate được tạo ra ở đây khác với oxaloacetate mở đầu của phản ứng 1 về thành phần carbon, oxaloacetate mới được bổ sung 2 carbon từ acetyl-CoA. Oxaloacetate mở đầu của phản ứng 1 có 2 carbon tham gia tạo CO2 ở phản ứng 3 và 4. Ý nghĩa của quá trình đường phân và chu trình Krebs - Là các đường hướng phân giải tạo ra các sản phẩm trung gian để tạo thành các cơ chất khác nhau cần cho sự sống. - Tạo các coenzyme khử và ATP. Việc tạo ra năng lượng, sử dụng năng lượng và coenzyme khử qua quá trình đường phân (glycolyis) và chu trình Krebs được tóm tắt như sau: Glucose→glucose 6-phosphate -1 ATP Fructose 6-phosphate → fructose 1,6-bisphosphate -1 ATP 2 Glyceraldehyde 3-phosphate → 2 1,3-bisphosphoglycerate 2 NADH 2 1,3-Bisphosphoglycerate → 2 3-phosphoglycerate 2 ATP 2 Phosphoenolpyruvate → 2 pyruvate 2 ATP 2 Pyruvate → 2acety-CoA 2 NADH 2 Isocitrate → 2 α-ketoglutarate 2 NADH 2 α-Ketoglutarate → 2 succinyl-CoA 2 NADH 2 Succinyl-CoA → 2 succinate 2 ATP (hoặc 2 GTP) 2 Succinate → 2 fumarate 2 FADH2 2 Malate → 2 oxaloacetate 2 NADH Chu trình citric acid Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát của chu trình citric acid Ở thực vật và một số vi khuẩn còn có đường hướng khác trong việc chuyển hóa acetylCoA. Các phản ứng của sự chuyển hóa này tạo nên chu trình gọi là chu trình glyoxylate. Giữa chu trình này và chu trình Krebs có những giai đọan giống nhau (hình 2.7). Hình 2.7. Tóm tắt chu trình glyoxylate Chu trình pentose phosphate Là sự phân giải trực tiếp glucose 6 Phosphate không qua quá trình đường phân, gồm 2 giai đoạn oxy hóa và tái tạo hexose phosphate. Pentose phosphate (hexose monophosphate) gây ra sự oxy hóa và sự khử carboxyl hóa C1 của glucose 6 Phosphate, khử NADP+ thành NADPH và pentose phosphate. NADPH cần cho các phản ứng sinh tổng hợp và pentose phosphate cần cho sự tổng hợp nucleotid và nucleic acid. Pha thứ nhất của pentose phosphate là qúa trình oxy hóa glucose 6 Phosphate để tạo ribulose 5 phosphate và khử NADP+ thành NADPH. Pha thứ hai (nonoxidative) chuyển hóa pentose phosphate thành glucose 6 Phosphate và bắt đầu chu trình trở lại. Hình 2.8. Sơ đồ pha thứ nhất của chu trình pentose phosphate Trong pha thứ hai, các phản ứng được xúc tác bởi transaldolase và transketolase. Hình 2.9. Sơ đồ pha thứ hai của chu trình pentose phosphate 2.3.2. Sự tổng hợp saccharide 2.3.2.1. Sự tổng hợp saccharide đơn giản. Quá trình quang hợp Cây xanh có thể hấp thụ CO2, khử nó thành saccharide. Đây là quá trình cần có sự tham gia của ánh sáng và diệp lục . Ta có thể khái quát quá trình quang hợp bằng phản ứng sau: Quá trình quang hợp gồm hai giai đoạn và có chức năng riêng: Giai đoạn 1: Xảy ra quá trình quang phân ly nước đồng thời giải phóng oxy phân tử: Cùng chlorophill và hệ thống chuyền điện tử, ATP sẽ được tổng hợp từ ADP và H 3PO4. Vì vậy người ta còn gọi quá trình này là sự phosphoryl hóa quang hợp hay quang phosphoryl hóa. Theo Arnon, điện tử bị tách ra khỏi clorophyll a khi được kích họat bởi photon nó sẽ đi theo hai con đường khác nhau: Con đường quang phosphoryl hóa vòng xảy ra ở hệ quang hóa I, điện tử xuất phát từ P700 qua hệ thống chuyền điện tử rồi trở lại P700. Con đường này chỉ cho phép tổng hợp ATP. Con đường quang phosphoryl hóa không vòng xảy ra khi có sự tham gia của hệ quang hoá I và II, Con đường này cho phép tổng hợp ATP và NADPH2. Khi mất điện tử, chlorophyll của hệ I tiếp tục nhận điện tử ở hệ II qua các khâu chuyền trung gian . Điện tử của phân tử sắc tố hệ II được bổ sung từ H2O. Như vậy con đường đi của điện tử trong quá trình này không khép kín và được gọi là quá trình quang phosphoryl hóa không vòng Hình 2.10. Sơ đồ tóm tắt quá trình vận chuyển điện tử ở quang phosphoryl hoá không vòng Giai đoạn 2: khử CO2 thành saccharide nhờ NADPH và ATP được tổng hợp ở giai đoạn 1. Chu trình Calvin ( chu trình C3): Chu trình cố định CO2 này do M. Calvin và cộng sự tìm ra năm 1951 và được gọi là chu trình Calvin hay chu trình C3. Đầu tiên phân tử CO2 kết hợp với ribulose 1,5 biphosphate để tạo 2 phân tử 3phosphoglycerate. Hai phân tử 3-phosphoglycerate được phosphoryl hóa nhờ enzyme 3phosphoglycerate kinase xúc tác tạo thành 1,3-biphosphoglycerat. Chất này bị khử dưới tác dụng của glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase để chuyển thành glyceraldehyde 3-phosphate. Nhờ tác dụng đồng phân hóa của triose phosphate isomerase: glyceraldehyde 3-phosphate tạo thành dihydroxyacetone phosphate. Sau đó có sự kết hợp giữa 2 phân tử glyceraldehyde 3phosphate và dihydroxyacetone phosphate bằng phản ứng chuyền aldose để tạo thành fructose 1,6 bi phosphate. Fructose 1, 6 biphosphate mất di 1 phosphate tạo thành fructose 6 phosphate, nó chính là nguyên liệu để tạo thành các hexose khác như glucose 6 phosphate. Từ các dạng đường này tổng hợp các oligosaccharide và polysaccharide khác Một phần fructose 6 phosphate chuyển hóa thành ribulose 1,5-biphosphate, đồng thời khép kín chu trình Hình 2.11. Sự kết hợp CO2 vào ribulose1,5-biphosphate Hình 2.12 : Sự tổng hợp đường và tinh bột ở tế bào thực vật Nhờ tác dụng đồng phân hóa của triose phosphate isomerase: glyceraldehyde 3-phosphate tạo thành dihydroxyacetone phosphate. Sau đó có sự kết hợp giữa 2 phân tử glyceraldehyde 3- phosphate và dihydroxyacetone phosphate bằng phản ứng chuyền aldose để tạo thành fructose 1,6 bi phosphate. Fructose 1, 6 biphosphate mất di 1 phosphate tạo thành fructose 6 phosphate, nó chính là nguyên liệu để tạo thành các hexose khác như glucose 6 phosphate. Từ các dạng đường này tổng hợp các oligosaccharide và polysaccharide khác (hình 2.12). Một phần fructose 6 phosphate chuyển hóa thành ribulose 1,5-biphosphate, đồng thời khép kín chu trình (hình 2.13). Hình 2.13: Sự tạo thành phân tử khởi đầu chu trình Calvin – ribulose 1,5-biphosphate Ghi chú: Các enzyme xúc tác cho chuỗi phản ứng: (1) Transaldolase 2)Fructose 1,6 -biphosphatase , 3)Transketolase , 4)Transaldolase , 5)Sepdoheptulose 1,7-biphosphatase , 6)Transketolase , 7)Ribose 5-phosphate isomerase , 8)Ribulose 5-phosphate epimerase , 9)Ribulose 5-phosphate kinase. Chu trình C3 là chu trình cơ bản nhất của thế giới thực vật xảy ra trong tất cả thực vật, dù là thực vật bậc cao hay bậc thấp, dù thực vật C3, C4 hay thực vật CAM. Chu trình Hatch-Slack (chu trình C4) : Năm 1966, hai nhà khoa học là Hatch và Slack nghiên cứu và phát hiện ra ngoài chu trình Calvin, một số thực vật nhiệt đới như lúa miến, ngô, mía, cỏ gà... có quá trình đồng hoá CO 2 theo con đường khác. Ở thực vật này sản phẩm quang hợp đầu tiên của quang hợp là oxalo acetic acid, một phân tử có 4 carbon, chứ không phải là 3-phosphoglycerate . Chu trình cố định CO 2 như vậy gọi là chu trình C4 hay chu trình Hatch-Slack và các thực vật cố định CO 2 theo con đường này gọi là thực vật C4. Có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của cây C4: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO 2 với hiệu quả cao nhất, còn một loại lục lạp chuyên khử CO2 thành các chất hữu cơ cho cây. Vì vậy mà hoạt động quang hợp của cây C 4 có hiệu quả hơn các nhóm thực vật khác. Kết quả là năng suất sinh học của cây C4 thường rất cao. Hình 2.14. Chu trình Hatch-Slack Con đường cố định CO2 ở thực vật CAM(Crassulaceae Acidetabolism) Đây là con đường quang hợp thích nghi với điều kiện khô hạn của thực vật mọng nước. Nhờ con đường quang hợp này mà khả năng chịu hạn của chúng rất cao, hơn hẳn các thực vật chịu hạn khác.Do quang hợp trong điều kiện quá khó khăn nên cường độ quang hợp của các thực vật nhóm này thường thấp, năng suất sinh học không cao và sinh trưởng chậm hơn các thực vật khác. Quá trình cố định CO 2: quá trình cố định CO 2 được thực hiện vào ban đêm. Ban đêm khi nhiệt độ không khí giảm xuống thì khí khổng mở ra để thoát hơi nước và CO 2 sẽ xâm nhập vào lá qua khí khổng mở. Quá trình tổng hợp monosaccharide (quá trình khử CO2): quá trình này diễn ra vào ban ngày khi có ánh sáng hoạt hoá hệ thống quang hoá và khí khổng đóng lại. Malic acid bị khử carboxyl hoá để giải phóng CO2 cung cấp cho chu trình C3. 2.3.2.2. Tổng hợp oligosaccharide Sự sinh tổng hợp oligosaccharide bằng phản ứng chuyền gốc glucosyl, dưới tác dụng của enzyme : glucosyl transferase Ví dụ: Ngoài ra dạng UDP-glucose cũng dễ dàng chuyền glucose cho fructose để tạo thành sucrose. Các dẫn xuất UDP của đường là những chất cho gốc glucosyl rất hoạt động Tổng hợp polysacharide cũng xảy ra bằng con đường chuyển gốc glucosyl như tổng hợp oligosaccharide . Chất cho gốc glucosyl còn có thể là oligosaccharide như maltose, sucrose… Sự chuyển gốc không chỉ tới C4 mà tới cả C6 để tạo mạch nhánh. Hình : Sự tạo thành Sucrose từ UDP - glucose và Fructose 6 – phosphate 2.4. Trao đổi lipide 2.4.1. Sự phân giải lipide 2.4.1.1. Phân giải glycerid Glycerid dễ dàng bị thủy phân do sự xúc tác của các loại lipase. Ở động vật sự thủy phân glycerid xảy ra nhanh chóng nhờ sự tác động của muối acid mật làm nhũ tương hóa glycerid nên dễ bị thủy phân. 2.4.1.2. Sự oxi hóa acid béo trong cơ thể sinh vật Acid béo bị phân giải bằng nhiều con đường: - α oxi hóa. - β oxi hóa. - ω oxi hóa. Trong đó con đường phổ biến và quan trọng nhất là β.oxi hóa. β.oxi hóa acid béo Sự phân giải acid béo bằng cách cắt dần từng cặp C, tức là tại vị trí Cα của chuỗi carbon. Các acid béo có mạch carbon chẵn và các acid béo có mạch carbon lẻ có cơ chế β.oxi hóa khác nhau ở giai đoạn cuối. Acid béo no và acid béo không no có sự khác nhau ở giai đoạn sau. * Đối với acid béo no có mạch C chẵn: Quá trình β.oxi hóa xảy ra qua nhiều phản ứng phức tạp: Các enzyme tham gia xúc tác các phản ứng trên là: 1. Acyl-CoA-Synthetase. 2. Acyl-CoA-Dehydrogenase. 3. Enoyl-CoA-Hydratase. 4. Hydroxy-acyl-Thiolase. Qua một chu kỳ phân cắt, phân tử acid béo ngắn bớt đi 2 carbon, kết quả cuối cùng của các chu kỳ phân cắt β.oxi hóa của acid béo là các phân tử acetyl-CoA . Nếu phân tử acid béo có n nguyên tử C thì sẽ tạo ra n/2 phân tử acetyl-CoA. Các phân tử acetyl-CoA tiếp tục bị phân giải qua chu trình Krebs để tạo CO2 và H2O. Về mặt năng lượng, quá trình β.oxi hóa tạo nên nguồn năng lượng lớn cung cấp cho các họat động sống của tế bào. Mỗi lần phân cắt bớt 2C sẽ tạo nên 1 NADH 2, 1FADH2, qua chuỗi hô hấp sẽ tổng hợp được 5 ATP. Đồng thời mỗi phân tử Acetyl-CoA bị phân giải thông qua chu trình Krebs sẽ tạo ra được 12ATP. Từ đó người ta tính được tổng số ATP được tạo ra do sự phân giải phân tử acid béo no, mạch cacbon chẵn có n nguyên tử C là: * Đối với acid béo no có mạch C lẻ Đối với các acid béo no có mạch C lẻ, quá trình phân giải theo phương thức β.oxi hóa xảy ra giống với acid béo no có mạch carbon chẵn nói ở trên nhưng sau lần phân cắt cuối cùng không phải tạo ra 2 phân tử Acetyl-CoA mà cho ta 1 phân tử Acetyl-CoA và 1 phân tử propionyl-CoA. Từ propionyl-CoA lại tiếp tục biến đổi thêm một chu kỳ β.oxi hóa nữa để tạo ra 1 phân tử CO2 và 1 phân tử Acetyl-CoA. Các enzyme xúc tác giống như ở chu trình trước * Đối với acid béo không no. Với acid béo không no, quá trình phân giải xảy ra tùy vị trí nối đôi. - Nếu vị trí nối đôi đúng vào vị trí β thì quá trình xảy ra giống như đối với acid béo no nhưng không xảy ra phản ứng 2. - Nếu vị trí nối đôi ở vị trí khác thì trước khi phân giải, acid béo không no bị khử để thành acid béo no tương ứng rồi tiếp tục phân giải theo con đường β.oxi hóa. α.oxi hóa Phương thức α.oxi hóa là sự phân giải acid béo xảy ra tại vị trí Cα, mỗi lần phân giải mạch C bị cắt ngắn đi 1 nguyên tử C và tạo ra CO2. 2.4.1.3. Phân giải glycerin Sau khi giải phóng khỏi lipid đơn giản, glycerin tiếp tục được biến đổi bằng nhiều cách để tạo nên các sản phẩm khác nhau Từ ALPG biến đổi thành pyruvic acid như trong quá trình đường phân, sau đó pyruvic acid bị phân giải tiếp thông qua chu trình Krebs để tạo CO2 và H2O. Như vậy sự phân giải glycerin xảy ra qua quá trình đường phân và qua chu trình Krebs để tạo sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O. Năng lượng giải phóng trong quá trình phân giải này được dùng để tổng hợp ATP cung cấp cho các họat động sống của tế bào. 2.4.1.4. Phân giải glycero phospho lipide Các glycero phospholipide bị phân giải qua nhiều giai đoạn tạo ra nhiều sản phẩm trung gian tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất. Quá trình phân giải này do nhiều enzyme thủy phân xúc tác. - Phospholipase A1 thuỷ phân liên kết giữa glycerin và acid béo thứ nhất. - Phospholipase A2 thủy phân liên kết giữa glycerin và acid béo thứ hai. - Phospholipasse B thủy phân cả hai loại liên kết trên. - Phospholipase C thủy phân liên kết giữa glycerin và H3PO4. - Phospholipase D thủy phân liên kết giữa H3PO4 với choline, ethanolamine hay serine. Phối hợp tác dụng của tất cả các loại enzyme nói trên, phân tử glycero phospholipid sẽ bị phân giải thành glycerin, acid béo, H3PO4 và choline (hay ethanolamine, serine) 2.4.2. Sinh tổng hợp lipide 2.4.2.1. Tổng hợp acid béo Acid béo được tổng hợp từ acetyl-CoA. Sự tổng hợp acid béo no và không no ở giai đoạn đầu giống nhau. Trước hết acid béo no được tổng hợp sau đó hình thành acid béo không no bằng cách oxi hóa các acid béo tương ứng. Quá trình tổng hợp acid béo từ acetyl-CoA xảy ra ngược với quá trình β.oxi hóa. Từ các acetyl-CoA được nối dần lại với nhau thành chuỗi trung bình rồi dẫn đến việc tạo thành Stearic acid (có 18C) là loại acid béo no chủ yếu của các mô. Từ Stearic acid có thể tiếp tục kéo dài thêm chuỗi carbon tạo nên các acid béo có mạch C dài hơn. Trước hết từ acetyl-CoA và CO2 kết hợp với nhau để tạo nên malonyl-CoA. Quá trình này được xúc tác bởi acetyl-CoA-carboxylase. ATP từ ADP theo phản ứng trên cần cung cấp năng lượng tương đương 7Kcal/mol. Nguồn năng lượng cung cấp cho quá trình phosphoryl hóa rất khác nhau. Sự phosphoryl hóa quang hóa là quá trình tổng hợp ATP ở lục lạp thể nhờ năng lượng ánh sáng xảy ra trong quang hợp. Sự phosphoryl hóa oxy hóa là quá trình tổng hợp ATP ở ty thể nhờ năng lượng thải ra trong các phản ứng oxy hóa khử. Theo quan niệm hiện nay, sự phosphoryl hóa oxy hóa là quá trình hình thành ATP bằng cách chuyển electron và proton trong chuỗi hô hấp tế bào. Sự Để tiến hành phản ứng ngưng tụ giữa acetyl-CoA với malonyl-CoA cần có sự tham gia của một loại protein có vai trò vận chuyển nhóm acyl, đó là protein vận chuyển gốc acyl-ACP. Tiếp theo acetyl-SACP và malonyl-SACP ngưng tụ với nhau với sự xúc tác của enzyme acyl-synthetase. Khi các phân tử acetyl-ACP và malonyl-ACP tác dụng với enzyme acylsynthetase sẽ xảy ra sự chuyển các gốc acetyl và malonyl từ nhóm SH của ACP sang nhóm SH của enzyme đồng thời CO2 được giải phóng. COOH – CH2 – CO ~ SACP + COOH – CO ~ SACP  CH3COCH2 – CO ~ SACP + CO2 + ACP - SH Từ CH3COCH2CO ~ SACP (aceto acetyl-ACP) bị khử thành β.hydroxy-butyryl-ACP. Phản ứng tiếp theo là β.hydroxy butyryl-ACP bị khử nước để tạo nên crotonyl-ACP. Crotonyl-ACP bị khử tạo nên butyryl-ACP Từ butyryl-ACP tiếp tục một chu kỳ mới ngưng tụ với malonyl-ACP để cho ta phântử có 6 nguyên tử C. Quá trình cứ tiếp diễn như vậy cho đến khi tạo ra đủ số C cần thiết của acid béo, sau đó Acyl-ACP này sẽ biến đổi trở lại thành Acyl-CoA và cuối cùng tạo ra acid béo no bằng cách cắt bỏ CoA-SH. Như vậy acid béo có mạch cacbon chẵn với n nguyên tử C thì quá trình sẽ diễn ra (2/1 – 1) chu kỳ. Nếu acid béo có mạch C lẻ thì trong các lần nối dài mạch C nói trên, lần đầu tiên không phải phản ứng xảy ra từ 2 Acetyl CoA mà xảy ra từ Acetyl-CoA và propionyl-CoA để tạo ra acyl-CoA có 5 nguyên tử C. Từ đó cứ mỗi chu kỳ lại nối thêm 1 phân tử Acetyl-CoA làm cho phân tử acid béo dài thêm 2 nguyên tử cacbon để cuối cùng tạo nên phân tử acid béo có số nguyên tử cacbon lẻ. Các acid béo không no được tạo ra từ các acid béo no tương ứng bằng cách bị oxy hóa bới FAD. 2.4.2.2. Tổng hợp glycerin Glycerin được tổng hợp bằng nhiều con đường. Con đường phổ biến là từ các sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi glucose là AlPG và PDA biến đổi thành 2.4.2.3 Tổng hợp glyceride Từ các acid béo và glycerin đã được tổng hợp sẽ tạo thành glyceride theo các phản ứng sau đây: 2.4.2.4. Tổng hợp glycero phospholipid Từ photphatidic acid sẽ tạo nên các loại phospho lipid khác nhau 2.4.2.5. Tổng hợp sterid Sterid được tạo nên bởi sterol và acid béo. Nguyên liệu để tổng hợp sterol là acetyl-CoA. Quá trình sinh tổng hợp sterol có thể chia làm 3 giai đoạn với nhiều phản ứng rất phức tạp. - Giai đoạn chuyển acetyl-CoA thành mevalonic acid. - Giai đoạn tổng hợp squalen. - Giai đoạn chuyển squalen thành cholesterol. 2.4.3. Sự ôi hóa của lipide trong quá trình bảo quản thực phẩm Khi bảo quản lâu, dưới tác dụng cuả nhiều nhân tố như ánh sáng, không khí, nhiệt độ, nước và vi sinh vật..., lipide bị thay đổi trạng thái, màu sắc và có mùi vị khó chịu. Thường người ta gọi quá trình tổng hợp này là sự ôi hoá. Thực chất cuả sự ôi hoá là quá trình oxy hoá. Tuy vậy, nếu dựa vào cơ chế phản ứng thì có thể phân ra ôi hoá do thuỷ phân và ôi hoá do oxy hoá. 2.4.3.1. Ôi hóa do phản ứng thủy phân Phản ứng thuỷ phân lipide cũng có thể xảy ra, khi có enzyme cũng như không có enzym xúc tác. Trường hợp thứ nhất xảy ra trong pha “béo” và chỉ có nước hoà tan trong lipit (dầu, mỡ) mới tham gia phản ứng, nghĩa là phản ứng tiến hành trong môi trường đồng thể. Khi trong lipide có mặt nước với một lượng đáng kể, nhưng ở nhiệt độ thường, thì vận tốc phản ứng cũng rất bé. Vì lẽ ở nhiệt độ thường vận tốc phản ứng thuỷ phân rất chậm. Hơn nữa khả năng không hoà tan cuả pha nước trong pha “béo” cũng ngăn cản sự tiếp xúc cần thiết giữa chúng. Trường hợp thuỷ phân do enzym xúc tác thường xảy ra ở trên bề mặt tiếp xúc giữa lipide và nước. Enzym lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân có thể có trong nguyên liệu cũng như do vi sinh vật mang vào. Chúng ta đều biết lipase là một globulin. Nó xúc tác không những phản ứng thuỷ phân mà cả phản ứng tổng hợp nữa. Do đó cân bằng phản ứng phụ thuộc vào từng ñiều kiện cụ thể mà có thể chuyển dịch về phải cũng như về trái. Khi hàm ẩm cao thì sự thuỷ phân ưu thế hơn sự tổng hợp. Ngược lại, trong hạt khô thì sự tổng hợp lại ưu thế hơn. Lipase có trong hạt và trong các cơ quan dinh dưỡng cuả cây. Lipase có nhiều trong hạt thầu dầu. Tác dụng o tối ưu cuả lipase cuả hạt là ở 35-38 C. Hoạt độ cuả nó giảm xuống một cách đáng kể khi chế biến thuỷ nhiệt các hạt cũng như khi ép nóng các hạt có dầu. Phản ứng thuỷ phân lipide sẽ tăng mạnh khi hạt bị nghiền cơ học hoặc bị tổn thương do côn trùng. Lipase có đặc hiệu thấp so với cấu trúc cuả lipide nhưng lại có ñặc hiệu quang học cao đ ối với những cơ chất có hoạt quang. Nói chung đối với những cơ chất không mang điện tích thì độ dài cuả mạch cacbon cuả acide béo tham gia trong lipide có ý nghiã lớn đối với hoạt độ cuả lipase. Trường hợp đơn giản nhất cuả sự ôi hoá do phản ứng thủy phân thường thấy khi bảo quản bơ và margarin. Khi đó sẽ giải phóng ra acide butylric là acide có mùi rất khó chịu. Trong chế biến lương thực, để bảo quản được hạt, bột và tấm, vai trò quyết định là nhiệt độ o và thủy phân. Chẳng hạn bột khi ở nhiệt độ dưới 5 C vẫn bảo quản được tốt ngay cả khi có hàm ẩm cao. Người ta nhận thấy rằng khi bảo quản bột có hàm ẩm cao hơn 15% thì phản ứng thuỷ phân chủ yếu là do emzym của nấm mốc. Khi đó độ axit cũng tăng liên do tích tụ cac acide hữu cơ hoà tan và bột sẽ có mùi vị khó chịu. Người ta còn nhận thấy đối với bột khô, nấm mốc không phát triển được, độ acide cũng tăng nhưng không có mùi vị acide, vì chủ yếu là tạo ra những axit béo không hoà tan trong nước. 2.4.3.2. Ôi hóa do phản ứng oxy hóa – khử Ôi hoá theo kiểu này là phổ biến nhất trong bảo quản các lipide. Thường người ta phân biệt hai loại: ôi hoá hoá học và ôi hoá sinh học. Ôi hoá hoá học là quá trình tự oxy hoá. Khi đó xảy ra sự tấn công các gốc acide béo tự do cũng như kết hợp bởi oxy phân tử. Áp suất của oxy và lượng nối đôi trong phân tử axit béo có ảnh hưởng đến tiến trình phản ứng. Sản phẩm đầu tiên là hydro peroxide. Từ đó tạo nên aldehyde no và không no, cetone, acide mono- và dicarboxylic, aldoacide, cetoacide, epoxyde v.v. Ngoài ra còn có thể trùng hợp hoá các sản phẩm oxy hoá nữa. Đa số những chất này có vai trò quyết định trong việc phát triển mùi vị. Ôi hoá sinh hoá học lại bao gồm sự ôi hoá do enzym lipoxygenase và sự ôi hoá cetone. Kiểu ôi hoá thứ hai này thường đặc trưng đối với lipide có chứa acide béo no với phân tử lượng trung bình và thấp, khi có hàm ẩm đáng kể. Khi đó acide béo bị -oxy hoá và decarboxyl hoá, kết quả sẽ là tích tụ các alkylmetylxeton có mùi khó chịu. Khi lipide bị ôi hoá, thường bị mất hoạt tính vitamin. Vì lẽ khi ñó các axit béo không no cao phân tử cũng như các vitamin ñều bị phá huỷ bởi các phẩm vật oxy tích tụ trong lipide. Các sản phẩm oxy hoá của lipide thường làm vô hoạt enzym và đặc biệt làm giảm hoạt độ của sucinoxydase, citocromoxydase và colinoxydase. Sản phẩm oxy hoá còn có khả năng phản ứng cao với protein. Hợp chất tạo thành này bền vững, không hoà tan trong nước cũng như trong dung môi hữu cơ và cũng không bị phân ly bởi enzym. Người ta còn cho rằng sự phát triển của bệnh vữa xơ động mạch là do sự tạo thành phức giữa sản phẩm oxy hoá của lipide với protein có trong thành phần của thành huyết quản. Lipide bị oxy hoá còn kìm hãm sự phát triển của động vật. Trong bảo quản lipide, người ta có thể dùng cộng tính cuả hai chất để làm tăng hiệu quả cuả chất chống oxy hoá. Chất làm tăng tính chất chống oxy hoá cuả chất kia gọi là chất hiệp trợ. Chất hiệp trợ này có hoặc không có tính chất chống oxy hoá. Bản chất cuả chúng có thể là vô cơ hay hữu cơ. Acide phosphoric, axit ascorbic, axit xitric và muối cuả chúng, polyphosphat, axit amin, xephalin là những chất thuộc loại đó. Cơ chế hiệp trợ cuả chúng là ở chổ chúng là những chất cho hydro để khử các dạng chất kìm hãm đã bị oxy hoá. Chẳng hạn kìm hãm sự oxy hoá chất béo bằng hỗn hợp axit ascorbic và quinon. Axit ascorbic chuyển hydro đ ến quinon đ ể cho chất này có tác dụng được với gốc peroxit. Quá trình chuyển hydro cũng được coi là sự hiệp trợ cuả axit ascorbic với tocoferol. Tác dụng hiệp trợ cuả -alanin đến hydroquinon trong chống oxy hoá cho dầu hướng dương là ở chổ khi bị deamin hoá đến axit pyruvic thì đồng thời cũng khử được hydroquinon đã bị oxy hoá. Các chất như tocoferol, xemazol, phosphatit, gossipol, quercetin...là những chất chống oxy hoá tự nhiên, vì thường chưá trong trong các nguồn lipit tự nhiên. Trong quá trình khai thác và tinh luyện, những chất này có thể bị mất đi, do ñó những nguồn lipit này dễ bị ôi hoá. Một số chất chống oxy hoá cũng được tân tạo khi gia công các hạt có dầu như melanoidin,gossiphosphatit, melanophosphatit...Hiện nay người ta còn sử dụng nhiều chất chống oxy hoá tổng hợp như butyloxyanizol, butyloxytoluen, dodexigalat v.v. trong bảo quản dầu mỡ. Oi hoá do enzyme lipoxydase Trong quá trình khai thác cũng như bảo quản, lipit và ñặc biệt là dầu mỡ, có thể bị oxy hoá dưới tác dụng xúc tác cuả enzym lipoxydase để tạo thành những sản phẩm khác nhau. Enzym lipoxygenase xúc tác sự oxy hoá các axit béo không no chưá 2-3 nối kép (hoặc nhiều hơn) như axit linoleic, linolenic, axit arachidic. Điểm đặc biệt là lipoxygenase chỉ oxy hoá dạng cis-cis còn dạng cis-trans hoặc trans-trans thì hoàn toàn không có tác dụng. Cả 3 axit này đều bị oxy hoá với vận tốc như nhau. điểm khác là các hydro peroxit được tạo thành ở đây có hình thể cis-trans và có hoạt động quang học. 2.5. Mối liên quan giữa các quá trình trao đổi chất Trong cơ thể mọi quá trình biến đổi các chất không xảy ra riêng rẽ mà có mối quan hệ qua lại rất chặt chẽ. Mối quan hệ thể hiện cả trong quá trình biến đổi của một nhóm chất lẫn trong mối quan hệ của quá trình biến đổi các nhóm chất khác nhau. Trong cùng một nhóm chất mối quan hệ thể hiện qua quá trình đồng hóa và dị hóa. Mối quan hệ tương hỗ của sự đồng hóa và dị hóa thể hiện cả hai quá trình xảy ra đều có các chất trung gian chung. Ví dụ phosphoglyceric aldehyde vừa là sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải (dị hóa) vừa là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp (đồng hóa) saccharose. Giữa các nhóm chất mối quan hệ diễn ra phức tạp hơn, nhiều hình thức hơn. Trước hết mối quan hệ được thể hiện qua các chất trung gian. Một chất là sản phẩm phân giải của nhóm chất này lại là nguyên liệu để tổng hợp cho nhóm chất khác. Ví dụ Acetyl-CoA là sản phẩm của quá trình phân giải glucose đồng thời nó là nguyên liệu để tổng hợp acid béo. Mối liên quan tương hỗ giữa các quá trình trao đổi saccharide, lipide, protein, nucleic acid có ý nghĩa quan trọng trong sự sống của sinh vật. Ví dụ việc chuyển hóa tinh bột thành đường sau đó tạo các chất béo trong những tháng mùa đông ở thực vật cũng như ở động vật, có ý nghĩa quan trọng trong việc tăng khả năng chịu rét của chúng. Việc ch...

Bài giảng: HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM

Nội dung