Nội dung

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) BM CNSH TV – Khoa CNSH 1 CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)       Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 2 Khái niệm thư viện DNA •Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tử DNA Thư viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn DNA (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một sinh vật) được chèn vào các vector nhân dòng Có hai loại thư viện mẫu chính đó là: 1. Thư viện genome (Genomic library): chứa toàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của một tổ chức hay cơ thể. Genomic library có thể được nhân dòng bằng plasmid hoặc genome của thực khuẩn thể. 2. Thư viện cDNA (cDNA library): chứa các đoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toàn bộ mARN của một mô. Thư viện cDNA được tạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA. Các bước trong tạo thư viện mẫu đã nhân dòng 1. Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên từ hệ gen hay cDNA 2. Chèn các đoạn DNA vào vector nhân dòng thích hợp. 3. Nhân các đoạn DNA tạo ra trong hệ thống tế bào chủ (chứa vector nhân dòng tương ứng) 4. Chọn lọc các dòng có chứa vector mang đoạn DNA mục tiêu. Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trình tự. • Mỗi một đoạn DNA cài trong một vector biến nạp trong 1 tế bào vi khuẩn  Sách (Book) • Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Thư viện Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng Kích thước của đoạn DNA tùy thuộc vào mục đích sử dụng thư viện • Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách dòng gen từ hệ gen có kích thước lớncần các đoạn DNA lớn và sử dụng các vectơ như phage, cosmid, BAC hay YAC • Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết… cần các đoạn DNA có kích thước nhỏ, sử dụng vectơ nhân dòng là plasmid • Các đoạn DNA phải có tính ngẫu nhiên để đảm bảo tính đại diện cho hệ gen. Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng • Làm gãy nhiễm sắc thể • Cắt bằng RE • Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 Nu (NotI, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn • Thông thường dùng RE có vùng nhận biết gồm 4 Nu (AluI, HaeIII) • Cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cách sử dụng phối hợp nhiều RE