Nội dung

Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại        Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Phương pháp PCR Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western) Kỹ thuật xác định trình tự DNA Các kỹ thuật xác đinh tính đa hình DNA (dựa trên PCR, dựa trên RELP) Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA Kỹ thuật lai phân tử Cơ sở khoa học  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity)  Các dạng phức hợp lai bổ sung 1) DNA-DNA. 2) DNA-RNA. 3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể ) Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới. Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN 42 C is more stringent condition that 35 C (hybridization is more specific) http://amiga1.med.miami.edu/Medical/PDF-Files/Lecture10.pdf Lai Southern Lµ kü thuËt dïng ®Ó nhËn d¹ng mét ®o¹n DNA ®Æc thï dùa trªn trình tù thÓ hiÖn cña nã sau khi ®iÖn di trªn gel agarose. Ph-¬ng ph¸p nµy ®-îc ph¸t triÓn bëi Edwin Southern (1975) nªn ®-îc gäi lµ ph-¬ng ph¸p “Southern Blot”. Kỹ thuật Southern Blot cho biết Sự có mặt của đoạn ADN (gen)  Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen)  Độ lớn của đoạn ADN  Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò  . Edwin Southern University of Oxford Nguyên tắc   Southern Blot dùa trªn khả năng giữ l¹i c¸c ®o¹n ADN ®· qua xö lý enzyme giíi h¹n, trªn mét mµng máng ®Æc biÖt (Hybond - N). Mµng máng nµy sau ®ã ®-îc ng©m trong dung dÞch chøa mẫu dò ®· cho ë d¹ng cã ®¸nh dÊu 32P. NÕu cã mÆt gen ®· cho trong ADN trªn mµng máng thì c¸c ®o¹n ADN cña cïng gen sÏ b¾t cÆp (lai) theo c¬ chÕ bæ sung (complementation) vµ nhËn biÕt qua phãng x¹ tù ghi.